一种特异性芽孢杆菌裂解酶及其制备方法、用途

本申请涉及生物工程，具体而言，涉及一种特异性芽孢杆菌裂解酶及其制备方法、用途。

背景技术：

1、芽孢杆菌是一种革兰氏阳性菌，其细胞壁是一层厚而致密的肽聚糖和磷壁酸组成因此具有极强抗逆作用、在高温、酸碱等极性环境下亦可生存。因此，现有技术中，通过使用抗生素杀死芽孢杆菌时，容易出现病菌对抗生素产生抗性等问题。在细菌裂解酶的特异性和高活性的特征下使用细菌裂解酶对芽孢杆菌进行裂解杀死的研究越来越备受关注。

技术实现思路

1、本申请实施例的目的在于提供一种特异性芽孢杆菌裂解酶及其制备方法、用途，其能够为细菌程序性死亡的探究提供了分子基础并且也为开发利用高效的水解芽孢杆菌裂解酶提供理论基础。

2、根据本申请的第一方面，提供了一种特异性芽孢杆菌裂解酶，所述裂解酶为n-乙酰胞壁酰-l-丙氨酸-酰胺酶，所述裂解酶基于贝莱斯芽孢杆菌fs001基因组测序数据分析获得。

3、根据本申请的第二方面，还提供了一种特异性芽孢杆菌裂解酶的制备方法，包括以下步骤：

4、s1、设计并合成扩增n-乙酰胞壁酰-l-丙氨酸-酰胺酶的引物，包括上游引物及下游引物。

5、所述上游引物的序列为：cgggatccggtggggattgaagtgaaaaa。

6、所述下游引物的序列为：ccgctcgagcagtttttcttcaattttcg。

7、s2、基于所述上游引物以及所述下游引物，并以贝莱斯芽孢杆菌fs001基因组为模板进行扩增，以获取目的基因片段。

8、s3、将所述目的基因片段与质粒连接，完成重组质粒的构建；所述重组质粒转化进入大肠杆菌进行表达。

9、s4、纯化后获取n-乙酰胞壁酰-l-丙氨酸-酰胺酶。

10、在一种可实施的方案中，在步骤s2中，扩增的条件至少包括：98℃预变性2min，98℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸10s，共设30个循环。

11、在一种可实施的方案中，在步骤s3之后，筛选含有n-乙酰胞壁酰-l-丙氨酸-酰胺酶基因的重组质粒，并进行双酶切和测序验证。

12、在一种可实施的方案中，在步骤s4中，所述纯化至少包：使用蛋白纯化系统进行蛋白纯化。

13、根据本申请的第三方面，还提供了一种裂解酶的用途，使用第一方面提供的裂解酶对芽孢杆菌进行特异性裂解。

14、在一种可实施的方案中，所述芽孢杆菌至少包括枯草芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、阿氏芽孢杆菌。

15、在一种可实施的方案中，所述特异性裂解的反应适宜条件至少包括：ph为6.5-7.5，温度为30-37℃。

16、在一种可实施的方案中，所述特异性裂解的反应适宜条件包括：ph为6.5，温度为37℃。

17、在一种可实施的方案中，通过吸光度测定确定所述裂解酶对芽孢杆菌进行裂解的效果。

18、与现有技术相比，本申请的有益效果为：

19、在本申请的技术方案中，根据本申请提供的裂解酶具有特异性和高活性，对病原菌特异性强且不干扰正常菌群；可杀死定殖在粘膜表面的病原菌；细菌对该裂解酶的耐药性几率低。可水解多种芽孢杆菌的细胞壁，能够高效裂解芽孢杆菌。对于抑制芽孢杆菌生长及生物医药和食品生产方面有很大的应用前景。

技术特征：

1.一种特异性芽孢杆菌裂解酶，其特征在于，所述裂解酶为n-乙酰胞壁酰-l-丙氨酸-酰胺酶，所述裂解酶基于贝莱斯芽孢杆菌fs001基因组测序数据分析获得；生物保藏编号为cgmccno.17946。

2.一种特异性芽孢杆菌裂解酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求1所述的裂解酶的制备方法，其特征在于，在步骤s2中，扩增的条件至少包括：98℃预变性2min，98℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸10s，30个循环。

4.根据权利要求2所述的裂解酶的制备方法，其特征在于，在步骤s3之后，筛选含有n-乙酰胞壁酰-l-丙氨酸-酰胺酶基因的重组质粒，并进行双酶切和测序验证。

5.根据权利要求3所述的裂解酶的制备方法，其特征在于，在步骤s4中，所述纯化至少包括：使用蛋白纯化系统进行蛋白纯化。

6.一种裂解酶的用途，其特征在于，使用权利要求1所述的裂解酶对芽孢杆菌进行特异性裂解。

7.根据权利要求6所述的裂解酶的用途，其特征在于，所述芽孢杆菌至少包括枯草芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、阿氏芽孢杆菌。

8.根据权利要求7所述的裂解酶的用途，其特征在于，所述特异性裂解的反应适宜条件至少包括：ph为6.5-7.5，温度为30-37℃。

9.根据权利要求8所述的裂解酶的用途，其特征在于，所述特异性裂解的反应适宜条件包括：ph为6.5，温度为37℃。

10.根据权利要求9所述的裂解酶的用途，其特征在于，通过吸光度测定确定所述裂解酶对芽孢杆菌进行裂解的效果。

技术总结
本申请提供了一种特异性芽孢杆菌裂解酶及其制备方法、用途，以一株贝莱斯芽孢杆菌FS001的基因组DNA为模板，设计并合成引物，通过PCR扩增xlyB(BSFS001GM003346)基因，将该基因与pET‑23b载体重组，在大肠杆菌E.coli BL21中进行诱导表达，采用Ni‑Sepharose亲和层析纯化得到较高纯度的重组N‑乙酰胞壁酰‑L‑丙氨酸‑酰胺酶蛋白。该裂解酶可水解多种芽孢杆菌的细胞壁。且在抑制芽孢杆菌生长及生物医药和食品生产方面有很大的应用前景。

技术研发人员：梁小波,王振宇,刘贻坦,冯应山,唐若诗
受保护的技术使用者：昆明理工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14