一种蜡样芽孢杆菌ATP合酶β亚基抗菌肽BaD9及其应用

本发明涉及生物，尤其涉及一种蜡样芽孢杆菌atp合酶β亚基抗菌肽bad9及其应用。

背景技术：

1、副溶血弧菌( vibrio parahaemolyticus)属于弧菌属，革兰氏阴性菌，是水产养殖中一种主要的致病菌，也是常见的五大食源性致病菌之一，人类食用被致病性副溶血性弧菌污染的海产品可能会引起急性肠胃炎。患者会出现头晕、腹泻、腹部痉挛、呕吐和发热等现象，严重时甚至引发脱水、昏迷等症状。金黄色葡萄球菌( staphylococcus aureus)属于葡萄球菌属，革兰氏阳性菌，是食物中常见的污染细菌，同属于五大食源性致病菌之一，能够产生肠毒素，引起食物中毒。感染金黄色葡萄球菌的患者会出现有恶心、呕吐，中上腹部痉挛性疼痛，继以腹泻等症状，其中呕吐最为突出。溶血性葡萄球菌( staphylococcus  haemolyticus)属于葡萄球菌属，革兰氏阳性菌，是人体体表正常定植菌，携带率仅次于表皮葡萄球菌，是典型的条件致病菌，常引起免疫力低下患者以及使用留置和植入性异物患者的感染，是引起医院感染的重要病原体。

2、抗生素用于细菌性疾病的治疗是人类医疗史上的一大重要进步，但由于抗生素滥用，导致细菌对抗生素的耐药性越来越严重，对人类健康造成重大威胁。同干扰病原微生物代谢过程的抗生素不同，抗菌肽大多是通过破坏微生物表面的细胞膜和诱导细胞内容物泄漏来产生抗菌作用，受到细菌耐药性影响概率最小。因此，抗菌肽被认为是抗生素的一种良好替代。

3、抗菌肽(amps)是一类广泛存在于生物体内的小分子肽，构成人体抵御病原体第一道防线的一部分，可有效抵抗病原微生物的入侵。抗菌肽具有广谱抗生物膜活性、利于调节宿主免疫反应、不易产生耐药性等特点，因此在治疗感染性疾病方面具有独特的优势，有望成为理想的抗感染药物。目前，人们已经从细菌、真菌、高等植物、动物等中发现并分离获得抗菌肽。

4、蜡样芽孢杆菌是一种革兰氏阳性，杆状并且能够形成孢子的兼性厌氧菌，经常在土壤、水、动物肠道中被发现，它可以产生毒素导致不同类型胃肠道疾病或其它疾病的致病菌。芽孢杆菌也可通过抗菌、营养竞争、位点排斥、寄生或诱导的方法对真菌病原体产生拮抗作用，同时其也能够产生的多种活性物质，例如低分子多肽、脂肽类抗生素和抗菌蛋白等可以有效抑制多种病原微生物的生长，具有良好的研究和应用价值。atp synthasesubunit beta(atpd， atp合成酶β亚基)，该基因编码线粒体atp合酶的一个亚基。线粒体atp合酶催化atp合成，利用氧化磷酸化过程中质子穿过内膜的电化学梯度。据研究表明，其对嗜冷杆菌的侵害具有有效的保护作用。因此，从蜡样芽孢杆菌atp合成酶β亚基中寻找具有抗菌活性的抗菌肽，并探究其抑菌机理，是本领域亟需解决的技术难题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种蜡样芽孢杆菌atp合酶β亚基抗菌肽bad9及其应用，解决了上述背景技术中的问题。

2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：提供了一种蜡样芽孢杆菌atp合酶β亚基抗菌肽bad9，其氨基酸序列如seq id no：1所示：

3、klvvhrarriqfflsqnfh

4、所述抗菌肽bad9的分子量为2396.831道尔顿，所带正电荷为+4.5，总疏水性比为47%，通过apd3预测该肽可能形成α螺旋。

5、本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：提供了一种蜡样芽孢杆菌atp合酶β亚基抗菌肽bad9在制备抗菌药物中的应用，该抗菌药物用于抑制和/或杀灭副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、溶血性葡萄球菌中的一种或多种。

6、本发明解决其技术问题所采用的技术方案之三是：提供了一种抗菌药物，其有效成分包括蜡样芽孢杆菌atp合酶β亚基抗菌肽bad9，所述抗菌肽bad9的氨基酸序列为seq idno：1。

7、在本发明一较佳实施例中，所述抗菌药物的有效成分为蜡样芽孢杆菌atp合酶β亚基抗菌肽bad9，所述抗菌肽bad9的氨基酸序列为seq id no：1。

8、在本发明一较佳实施例中，所述抗菌药物用于抑制和/或杀灭副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、溶血性葡萄球菌中的一种或多种。

9、本发明解决其技术问题所采用的技术方案之四是：提供了一种蜡样芽孢杆菌atp合酶β亚基抗菌肽bad9在制备食品防腐剂中的应用，该食品防腐剂用于抑制和/或杀灭副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、溶血性葡萄球菌中的一种或多种。

10、本发明解决其技术问题所采用的技术方案之五是：提供了一种食品防腐剂，其有效成分包括蜡样芽孢杆菌atp合酶β亚基抗菌肽bad9，所述抗菌肽bad9的氨基酸序列为seqid no：1。

11、在本发明一较佳实施例中，所述食品防腐剂的有效成分为蜡样芽孢杆菌atp合酶β亚基抗菌肽bad9，所述抗菌肽bad9的氨基酸序列为seq id no：1。

12、在本发明一较佳实施例中，所述食品防腐剂用于抑制和/或杀灭副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、溶血性葡萄球菌中的一种或多种。

13、本发明解决其技术问题所采用的技术方案之六是：提供了一种蜡样芽孢杆菌atp合酶β亚基抗菌肽bad9在制备水产饲料添加剂中的应用，该水产饲料添加剂用于抑制和/或杀灭副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、溶血性葡萄球菌中的一种或多种。

14、本发明解决其技术问题所采用的技术方案之七是：提供了一种水产饲料添加剂，其有效成分包括蜡样芽孢杆菌atp合酶β亚基抗菌肽bad9，所述抗菌肽bad9的氨基酸序列为seq id no：1。

15、在本发明一较佳实施例中，所述水产饲料添加剂的有效成分为蜡样芽孢杆菌atp合酶β亚基抗菌肽bad9，所述抗菌肽bad9的氨基酸序列为seq id no：1。

16、在本发明一较佳实施例中，所述水产饲料添加剂用于抑制和/或杀灭副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、溶血性葡萄球菌中的一种或多种。

17、本发明利用apd3、pymol2.0、swiss-model等软件及网站以蜡样芽孢杆菌具有抗菌活性的atp合成酶β亚基蛋白的蛋白序列为对象进行生物信息学预测，得到一个新的氨基酸序列的多肽bad9。研究bad9对副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、溶血性葡萄球菌的抑菌活性；并以副溶血性弧菌为例，利用流式细胞术、pi染色观察bad9对细菌细胞膜的破坏程度；同时提取副溶血性弧菌的基因组dna，验证其对细菌dna的影响作用。实验结果表明，该肽对副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、溶血性葡萄球菌具有明显抑制作用。本发明抗菌肽bad9为阳离子抗菌肽，其所携带的正电荷能够与阴离子细菌膜通过静电相互作用结合，以此来吸附在细菌膜上，改变细胞膜上的电位导致细胞膜损伤，发挥其抗菌功效。且抗菌肽bad9的α-螺旋结构，可以诱导细菌表面形成跨膜孔洞，以此帮助抗菌肽穿过细胞膜或让脂质体和细胞中的生物大分子产生泄露。因此，不论是革兰氏阳性菌还是阴性菌，抗菌肽bad9与其细胞膜表面结合方式相同，且结合mbc、time-kill时间结果可得该抗菌肽对副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、溶血性葡萄球菌均有抑制作用。

18、抗菌肽bad9将从以下作用对细菌造成破坏：抗菌肽bad9可以穿透细胞膜，与细菌基因组dna相结合，抑制细菌dna的合成，从而导致细菌死亡。

19、本发明的抗菌肽可以采用本领域技术人员已知的方法合成，例如固相合成，并采用本领域技术人员已知的方法进行纯化，例如高效液相色谱法。

20、实施本发明，具有如下有益效果：

21、本发明通过筛选，发现一个全新氨基酸序列的多肽bad9。研究bad9对副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、溶血性葡萄球菌具有明显抑制作用。它的抑菌机理是首先穿透细菌的细胞膜，然后与细菌基因组dna相结合，抑制细菌dna的合成，从而导致细菌死亡。本发明抗菌肽bad9可被制成抗菌药物或水产饲料添加剂用于预防或治疗副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、溶血性葡萄球菌感染引起的疾病。