一种鉴定水稻H23转化体的特异性探针、引物、试剂盒和方法

本发明属于分子生物，具体涉及一种用于鉴定水稻h23转化体的探针、探针和引物组合、标准品、real-time pcr检测试剂盒和检测方法。

背景技术：

1、水稻转化体h23是一种抗虫耐草铵膦除草剂的水稻转基因材料，它对褐飞虱具有优异的抗性，对草铵膦具有良好的耐受性，利用该转化体能培育抗虫抗除草剂水稻品种。建立转化体特异性检测方法能为转基因生物的鉴定和监管提供有效的检测手段，为农业转基因生物安全管理提供技术支撑。与普通pcr和染料法real-time pcr(实时荧光定量pcr)相比，探针法实时荧光定量pcr方法具有耗时短、操作简便、特异性好、灵敏度高和通量大等优势，过程可实时监控，结果可直接观察，可以对大量样品进行高效率的定量检测。

2、水稻转化体h23及其检测方法已公开，专利申请号为202011498142.7，公开的检测方法是普通pcr，其中所设计的检测引物之间的pcr产物长度过大(908bp和901bp)，不适合直接用于real-time pcr方法检测，尤其是应用探针法的real-time pcr检测。因此，需要进一步建立专门的real-time pcr检测体系。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供了一种新的用于检测水稻h23转化体的探针、探针和引物组合、标准品、检测试剂盒、real-time pcr检测方法。本发明通过设计高灵敏度、特异性的探针、上游引物和下游引物，标准品，既能准确鉴定水稻h23转化体，能将其与不含h23的常规水稻和其他转基因水稻材料分开，还能完成微量h23的样品(含量不低于25拷贝/μl)的拷贝数鉴定。该检测方法具有极高的特异性和灵敏性，操作简便，能高通量完成大量样品的定量检测。

2、本发明提供了一种探针，其特征在于：所述探针的核苷酸序列为5'-catggcctcctttgaacacc-3'。

3、在一些实施方案中，所述探针5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团。当探针处于游离状态时，荧光基团发出的荧光会被淬灭基团吸收；在pcr扩增过程中，与模板紧密结合的探针5’端荧光基团会被taq酶切开，从而远离3’端的淬灭基团，荧光基团发出的荧光能被仪器接收，产生的荧光信号与样本中扩增产物的量成正比。

4、在一些实施方案中，所述荧光基团包括fam、tet、hex、cy3、joe、vic、rox、cy5、tamra或texas中的任一种；所述淬灭基团包括bhq1、bhq2、bhq-x、tamra、dabcyl或mgb中的任一种；

5、在一些实施方案中，5’端标记fam、3’端标记bhq1的探针标记成本最低，可以作为最优选的探针标记方案。

6、本发明还提供了一种引物和探针组合，其特征在于：包括权利要求1所述的探针和两条引物，所述引物的核苷酸序列为5'-acgtccgcaatgtgttattaagt-3'和5'-ctatcaaggcttcccaaatgcag-3'；

7、上述的探针以及探针和引物组合是通过软件设计和人工组合、双重试验筛选以及多次pcr试验验证挑选出来的，定位于h23转化体外源插入序列下游边界的基因组和载体序列上。

8、本发明还提供了一种检测标准品，其特征在于：所述标准品为浓度不低于25拷贝/μl的一个或多个dna样品；

9、在一些实施方案中，所述检测标准品为6个水稻h23基因组dna，浓度分别为80000拷贝/μl、16000拷贝/μl、3200拷贝/μl、640拷贝/μl、128拷贝/μl、25拷贝/μl的dna样品；

10、在一些实施方案中，所述标准品的制备方法为：取浓度为0.2μg/μl的水稻h23基因组dna溶液依次稀释5倍、25倍、125倍、625倍、3125倍和15625倍。

11、本发明还提供了一种检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒包括上述的探针和引物组合以及上述的标准品；

12、在一些实施方案中，所述检测试剂盒包括：

13、引物1，序列为5'-acgtccgcaatgtgttattaagt-3'；

14、引物2，序列为5'-ctatcaaggcttcccaaatgcag-3'；

15、探针，序列为5'-catggcctcctttgaacacc-3”；

16、标准品，所述检测标准品为6个水稻h23基因组dna，浓度分别为80000拷贝/μl、16000拷贝/μl、3200拷贝/μl、640拷贝/μl、128拷贝/μl、25拷贝/μl的dna样品；

17、其中，所述探针5’端标记荧光基团fam，3’端标记淬灭基团bhq1。

18、本发明还提供了一种real-time pcr检测方法，其特征在于：使用上述的检测试剂盒进行real-time pcr检测，其中pcr反应体系中的引物1和引物2终浓度均为0.4μm，探针终浓度为0.2μm。

19、本发明还提供了上述的探针、探针和引物组合、检测标准品、检测试剂盒、检测方法在定性或定量检测核酸样品中的应用；其中，所述水稻h23转化体含有seq id no.1所示序列的核酸分子。

20、本发明的有益效果是：经过软件设计、人工组合以及多次试验筛选，从500多组探针引物池中获得了1条探针和2条引物的组合，在此基础上利用合适浓度梯度的标准品建立并优化了real-time pcr检测方法，应用上述探针、探针和引物组合、标准品、检测试剂盒、real-time pcr检测方法可以特异性地检测不低于25拷贝/μl的含有seq id no.1的核酸样品，并能有效地将h23材料与其他不含h23的水稻材料区分开，具有极高的灵敏度和特异性。

技术特征：

1.探针，其特征在于：所述探针的核苷酸序列为5'-catggcctcctttgaacacc-3'；

2.引物和探针组合，其特征在于：包括权利要求1所述的探针和两条引物，所述引物的核苷酸序列为5'-acgtccgcaatgtgttattaagt-3'和5'-

3.检测标准品，其特征在于：所述标准品为水稻h23基因组dna，浓度不低于25拷贝/μl的一个或多个dna样品；

4.检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒包括权利要求2所述的探针和引物组合以及权利要求3所述的标准品；

5.real-time pcr检测方法，其特征在于：使用权利要求4所述的检测试剂盒进行real-time pcr检测，其中pcr反应体系中的引物1和引物2终浓度均为0.4μm，探针终浓度为0.2μm。

6.权利要求1所述的探针、权利要求2所述的探针和引物组合、权利要求3所述的检测标准品、权利要求4所述的检测试剂盒、权利要求5所述的检测方法在定性或定量检测水稻h23转化体中的应用；

技术总结
本发明提供了一种探针、探针和引物组合、标准品、检测试剂盒、Real‑time PCR检测方法及其在定性或定量检测水稻H23转化体中的应用。

技术研发人员：李三和,游艾青,周雷,吴边,李昌焱,刘凯,陈俊孝,闸雯俊,徐华山,李培德,杨国才,刘凯,陈志军,石少阶,吴艳
受保护的技术使用者：湖北省农业科学院粮食作物研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14