重编程巨噬细胞、制备方法、细胞群、治疗产品及应用与流程

本发明属于生物疫苗，特别是涉及一种重编程巨噬细胞、制备方法、细胞群、治疗产品及应用。

背景技术：

1、在全球范围内，有8.44亿人患有慢性肝病，每年约有200万人死亡，发病率逐年上升。任何原因引起的反复性肝损伤都会导致纤维化，并最终导致肝硬化。目前，除了器官移植外，肝硬化没有治愈选择，而器官移植需要大型手术和终身免疫抑制，同时供体器官的可用性也限制了移植的可行性。因此，肝纤维化的程度与患者的预后相关。因而，慢性肝病患者迫切需要有效抗纤维化的疗法。

2、目前，临床上尚无特异有效的抗纤维化治疗方法。常采用的治疗手段主要是通过治疗引起肝损伤的基础疾病来缓解肝损伤和炎症。但这种治疗手段仅仅属于保守治疗方法并不能从根本上解决纤维化疾病。芝加哥大学在专利cn112236445a中公开了一种包含重组细胞外基质(ecm)靶向蛋白和/或重组蛋白酶的巨噬细胞。本专利基于重组细胞外基质(ecm)靶向蛋白和/或重组蛋白酶对ecm的降解功能，可提高巨噬细胞治疗纤维化和改善纤维化病变的能力。然而由实验结果可知，上述方法虽然在一定程度上可以减少肝纤维化，但其治疗效果还有待提高，并且目前现有的特异有效抗纤维化治疗方法仍存在较大空缺。

技术实现思路

1、为解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种重编程巨噬细胞、制备方法、细胞群、治疗产品及应用。本发明根据组织纤维化的病变进程特点，提出了从抑制纤维化、降解纤维化胞外基质到吞噬纤维化细胞的全面、系统地纤维化疾病治疗技术构思，并提供了重编程巨噬细胞。该重编程巨噬细胞在现有技术的基础上对巨噬细胞进行了进一步的工程化改进，改进后的巨噬细胞含有抗炎作用基因的信息载体、吞噬作用基因的信息载体和降解胞外基质基因的信息载体。在抗纤维化治疗过程中，本发明提供的重编程巨噬细胞，不仅能抵抗炎症反应和减少纤维化病变外，还能降解纤维化细胞胞外基质，更能吞噬纤维化细胞，实现对纤维化细胞的消除。由此可知，本发明实施例提供的重编程巨噬细胞是从多角度对纤维化组织进行治疗，可达到特异有效的抗纤维化目的。具体内容如下：

2、第一方面，本发明实施例提供了一种重编程巨噬细胞。该重编程巨噬细胞包含：具有抗炎作用基因的信息载体、具有吞噬作用基因的信息载体以及降解胞外基质基因的信息载体。

3、在一些实施例中，信息载体为dna、rna、病毒和纳米颗粒中的任意一种或多种组合。

4、在一些实施例中，抗炎作用基因包括：促m2型稳态的基因和/或促巨噬细胞极化的基因。

5、在一些实施例中，促m2型稳态的基因为编码m-csf的基因；促巨噬细胞极化的基因为编码il-4的基因、编码il-10的基因和编码分泌性白细胞蛋白酶抑制剂的基因中的一种或多种。

6、在一些实施例中，吞噬作用基因包括：识别ptdser的受体的基因和/或识别ptdser可溶性桥接蛋白的受体的基因。

7、在一些实施例中，识别ptdser的受体包括：识别ptdser的受体包括：tim受体、整合素、cd300受体和粘附型g蛋白偶联受体中的一种或多种；

8、在一些实施例中，识别ptdser可溶性桥接蛋白的受体为tam受体。

9、在一些实施例中，tim受体包括：tim-1、tim-3和tim-4中的一种或多种；和/或

10、tam受体包括：tyro3、axl和mer中的一种或多种；和/或

11、整合素包括：αmβ2整合素、αxβ2整合素、αvβ3整合素和αvβ5整合素中的一种或多种；和/或

12、cd300受体包括：cd300a、cd300b、cd300c、cd300d、cd300e、cd300f和cd300g中的一种或多种。

13、在一些实施例中，降解胞外基质基因包括基质降解酶的基因；其中，基质降解酶为胶原酶、明胶酶和基质金属蛋白酶中的一种或多种。

14、在一些实施例中，胶原酶为mmp8、mmp1和mmp13中的一种或多种组合；明胶酶为mmp2和/或mmp9；基质金属蛋白酶为mmp12。

15、在一些实施例中，巨噬细胞是m2特异性巨噬细胞。

16、在一些实施例中，巨噬细胞由自体外周血单核细胞诱导所得。

17、在一些实施例中，具有抗炎作用基因的信息载体、具有吞噬作用基因的信息载体以及降解胞外基质基因的信息载体，均是体外制备的。

18、在一些实施例中，抗炎作用基因、吞噬作用基因以及降解胞外基质基因，三者的制备模板均源于巨噬细胞。

19、第二方面，本发明实施例提供了一种细胞群。该细胞群包含第一方面提供的重编程巨噬细胞。

20、第三方面，本发明实施例提供了一种细胞治疗产品。细胞治疗产品包含第一方面提供的重编程巨噬细胞或包含第二方面提供的细胞群。

21、第四方面，本发明实施例提供了一种第一方面提供的重编程巨噬细胞或第二方面提供的细胞群的应用。该应用包括：在治疗纤维化疾病中的应用。

22、在一些实施例中，纤维化疾病为肝纤维化、心脏纤维化、肺纤维化、关节纤维化、骨髓纤维化、纵隔纤维化、腹膜后纤维化、肾因性全身性纤维化以及瘢痕瘤、克罗恩病、乳房纤维囊肿和佩罗尼病等中的任何一种。

23、第五方面，本发明实施例提供了一种第一方面所述重编程巨噬细胞或第二方面所述细胞群的冻存方式。

24、第六方面，本发明实施例提供了一种制备第一方面提供的重编程巨噬细胞的方法。

25、在一些实施例中，上述制备方法可以包括：分别构建具有抗炎作用基因的信息载体、降解胞外基质基因的信息载体以及具有吞噬作用基因的信息载体；

26、将构建的上述三种信息载体导入巨噬细胞中。

27、在一些实施例中，当信息载体为mrna时，具有抗炎作用基因的信息载体的载入量为1～5μg/105细胞，具有吞噬作用基因的信息载体的载入量为1～5μg/105细胞；降解胞外基质基因的信息载体的载入量为1～5μg/105细胞。

28、具体实施时，具有抗炎作用基因的信息载体的载入量可以为1μg/105细胞，2μg/105细胞，3μg/105细胞，4μg/105细胞，5μg/105细胞；具有吞噬作用基因的信息载体的的载入量可以为1μg/105细胞，2μg/105细胞，3μg/105细胞，4μg/105细胞，5μg/105细胞；降解胞外基质基因的信息载体的载入量可以为1μg/105细胞，2μg/105细胞，3μg/105细胞，4μg/105细胞，5μg/105细胞。这三种载入量也可以根据实际需求进行调整或任意组合。

29、在一些实施例中，当信息载体为dna时，具有抗炎作用基因的信息载体的载入量为0.5～1μg/105细胞，具有吞噬作用基因的信息载体的载入量为0.5～1μg/105细胞；降解胞外基质基因的信息载体的载入量为0.5～1μg/105细胞。

30、具体实施时，具有抗炎作用基因的信息载体的载入量可以为0.5μg/105细胞，0.6μg/105细胞，0.7μg/105细胞，0.8μg/105细胞，0.9μg/105细胞，1μg/105细胞；具有吞噬作用基因的信息载体的的载入量可以为0.5μg/105细胞，0.6μg/105细胞，0.7μg/105细胞，0.8μg/105细胞，0.9μg/105细胞，1μg/105细胞；降解胞外基质基因的信息载体的载入量可以为0.5μg/105细胞，0.6μg/105细胞，0.7μg/105细胞，0.8μg/105细胞，0.9μg/105细胞，1μg/105细胞。这三种载入量也可以根据实际需求进行调整或任意组合。

31、在一些实施例中，当信息载体为纳米颗粒时，载入量为0.5～5μg/105细胞。

32、具体实施时，具有抗炎作用基因的信息载体的载入量可以为0.5μg/105细胞，0.6μg/105细胞，0.7μg/105细胞，0.8μg/105细胞，0.9μg/105细胞，1μg/105细胞，2μg/105细胞，3μg/105细胞，4μg/105细胞，5μg/105细胞；具有吞噬作用基因的信息载体的的载入量可以为0.5μg/105细胞，0.6μg/105细胞，0.7μg/105细胞，0.8μg/105细胞，0.9μg/105细胞，1μg/105细胞，2μg/105细胞，3μg/105细胞，4μg/105细胞，5μg/105细胞；降解胞外基质基因的信息载体的载入量可以为0.5μg/105细胞，0.6μg/105细胞，0.7μg/105细胞，0.8μg/105细胞，0.9μg/105细胞，1μg/105细胞，2μg/105细胞，3μg/105细胞，4μg/105细胞，5μg/105细胞。这三种载入量也可以根据实际需求进行调整或任意组合。

33、在一些实施例中，导入的操作是利用电转系统或纳米颗粒实现的。

34、在一些实施例中，利用电转系统时，所采用的电压为250～300v，电转时间为8～12ms。

35、本发明的有益效果在于：本发明提供的重编程巨噬细胞内含有具有抗炎作用基因的信息载体、降解胞外基质基因的信息载体以及吞噬作用基因的信息载体。在抗纤维化治疗过程中，本发明提供的重编程巨噬细胞，不仅能抵抗炎症反应和减少纤维化病变外，还能降解纤维化细胞胞外基质，更能吞噬纤维化细胞，实现对纤维化细胞的消除。即，本发明实施例提供的重编程巨噬细胞是从多角度对纤维化组织进行治疗，可达到特异有效的抗纤维化目的。

36、并且，由体内实验结果可知，经过该重编程巨噬细胞治疗后的小鼠肝脏中天狼猩红和α-sma比例下降，这指示重编程巨噬细胞可改善肝纤维化、刺激肝脏再生并改善功能；由体外实验数据可知，该重编程巨噬细胞不仅对细胞外基质具有较高降解能力，还具有较高的吞噬凋亡细胞的能力，也具有较高的抗炎能力。由此可知，本发明提供的重编程巨噬细胞可作为治疗抗纤维化疾病用材料，用于靶向治疗纤维化疾病。