同时检测四种鱼类病毒的重组酶聚合酶可视化扩增试纸条的制作方法

本发明属于病毒检测，具体为一种同时检测四种鱼类病毒的重组酶聚合酶可视化扩增试纸条。

背景技术：

1、核酸扩增技术，包括pcr技术与恒温核酸扩增技术是目前病原体检测最灵敏的方法。近年来，pcr技术已成为临床检验的主流技术，但由于对仪器、实验室及实验人员要求高，一直局限于中心实验室内，无法为社区、学校、部队门诊等基层卫生部门服务，更无法应用于农村、野外等资源匮乏地区。

2、恒温核酸扩增技术是近年来新兴的分子诊断技术，可实现恒温下核酸快速扩增，无需昂贵精密的仪器，其中以环介导恒温扩增技术(loop-mediated isothermalamplification，lamp)应用最为广泛，它能在65℃恒温条件下进行核酸扩增，且加入核酸染料后能实现结果可视化，但缺点是引物设计复杂，仍需特异的加热设备，并且核酸染料对扩增有抑制作用，会导致检测灵敏度降低和稳定性差。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是：克服现有技术中存在的临床检验局限性大、引物设计复杂、需要特异加热设备等问题，提供一种同时检测四种鱼类病毒的重组酶聚合酶可视化扩增试纸条。

2、本发明解决上述技术问题的技术方案如下：本发明提供一种同时检测四种鱼类病毒的rpa引物和探针，包括：

3、svcv rpa引物f：5’-tctggatggatctgccatgcagctgaa-3’；

4、svcv rpa引物r：5’-gactgatgaagatctggggtttcccc-3’；

5、svcv检测探针：5’-tcggatgaatactgtggg-3’；

6、ihnv rpa引物f：5’-acatcaaggggggagtcctcgaggat-3’；

7、ihnv rpa引物r：5’-gcgaaggtagcgtctggtggtgcc’；

8、ihnv检测探针：5’-tctcgttccctctcctcc-3’；

9、ehnv rpa引物f：5’-cagcacagtcagggacatggtcgtggagc-3’；

10、ehnv rpa引物r：5’-gacgggagtggcgcaggtgtaattggag-3’；

11、ehnv检测探针：5’-ggttgaccatgtggactgg-3’；

12、vhsv rpa引物f：5’-gacgaggcaagcaaggatcacgagta-3’；

13、vhsv rpa引物r：5’-tctatgaaatcagggttgagaaatttc-3’；

14、vhsv检测探针：5’-tcatccagatgcagga-3’。

15、还提供一种利用所述的rpa引物和探针进行rna扩增试纸的制备：

16、s1：获取待测病毒的dna；

17、s2：四种病毒检测探针(10nmol/ml)取5μl，与15μl缓冲液(0.15mol/l naoh溶液，0.015mol/l柠檬酸钠，20mmol/l edta溶液)混匀，室温作用10min，再分别点于硝酸纤维素膜上；

18、s3：硝酸纤维膜上标记好每种病毒探针的位置，每种病毒探针点3次，每点点样8μl，晾干，重复点三次；

19、s4：于365nm紫外光源下以90mj/cm2的强度下照射使探针能固定在膜上；最后用0.05g/ml脱脂奶粉于37℃封闭1.5h，备用。

20、还提供一种同时检测四种鱼类病毒的rna扩增试纸检测方法：

21、s1：取检测试纸膜条，放入15ml离心管中5ml杂交缓冲液(0.015mol/l柠檬酸钠、0.15mol/l nacl，ph7.0)，加入5μl rpa扩增产物，于60℃反应10min。加入10ml洗液(0.015mol/l柠檬酸钠、0.15mol/l nacl、0.1％ sds)清洗膜条。

22、s2：取出膜条后，使用pbs缓冲液(2.7mmol/l kcl、4.3mmol/l na2hpo4、1.4mmol/lkh2po4、0.3％ triton x-100，ph7.4)对hrp-标记链霉亲和素进行1:2000稀释，将膜条与5ml稀释hrp-标记链霉亲和素室温反应5min；

23、s3：最后加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺显色底物避光显色5min，适时终止并观察结果；

24、s4：取10μl反应产物进行2％(m/v)琼脂糖凝胶电泳检测，可观察到四种病毒扩增条带，且扩增条带符合预期大小，表示四种病毒rpa方法建立成功。

25、进一步的，所述的rpa引物和探针、试纸的制备及试纸检测方法在同时检测四种鱼类病毒中的应用。

26、与现有技术相比，本发明的有益效果是：结合重组酶聚合酶扩增(recombinasepolymerase amplification，rpa)技术与酶联免疫放大技术，采用生物素标记的引物进行rpa扩增，所得扩增产物为试纸检测提供了可行性保障。试纸型检测方法操作快速简便、适用面广、成本低，符合水生动物疫病检测技术的发展方向。

27、为进一步提高检测的特异性，实验中硝酸纤维素膜上固定的检测探针都是针对rpa序列设计的，以尽量避免由背景序列对杂交反应造成的干扰。试纸检测方法的准确性和特异性是能够满足常规检测要求的，更宽的靶dna选择范围、更广泛的样本适应性，也是未来研究需要扩展的内容。通过更为深入的研究，采用rpa及酶联相关技术，实现以试纸法同时检出4种鱼类病原体，该方法操作简单且读取结果更为方便快捷，摆脱了对仪器的依赖，特异性良好，灵敏度也完全符合要求，甚至比rt-pcr更高，特别适合我国基层养殖场使用，对未来大范围水生动物疫病监测工作有重要意义。

技术特征：

1.一种同时检测四种鱼类病毒的rpa引物和探针，其特征在于，包括：

2.一种利用权利要求1所述的rpa引物和探针进行rpa扩增试纸的制备，其特征在于：

3.一种同时检测四种鱼类病毒的rpa扩增试纸检测方法，其特征在于：

4.根据权利要求1-3所述的rpa引物和探针、rpa扩增试纸的制备及rpa扩增试纸检测方法在同时检测四种鱼类病毒中的应用。

技术总结
本发明属于病毒检测技术领域，具体为一种同时检测四种鱼类病毒的重组酶聚合酶可视化扩增试纸条。本发明提供了同时检测四种鱼类病毒的RPA引物和探针，基于述RPA引物和探针建立的RPA扩增试纸及检测方法可以特异性、高灵敏度的同时检测四种鱼类病毒。本发明的试纸型检测方法操作快速简便、适用面广、成本低，符合水生动物疫病检测技术的发展方向；该方法操作简单且读取结果更为方便快捷，摆脱了对仪器的依赖，特异性良好，灵敏度也完全符合要求，甚至比RT‑PCR更高，特别适合我国基层养殖场使用，对未来大范围水生动物疫病监测工作有重要意义。

技术研发人员：尹伟力,梁君妮,魏玮,杨卫海,杨柏,张静,曲志勇
受保护的技术使用者：烟台海关技术中心
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13