特异性结合鹅膏毒肽α的适配体及检测鹅膏毒肽α的方法

本发明属于生物医学，涉及生物检测技术，具体涉及一种特异性结合鹅膏毒肽α的适配体及检测鹅膏毒肽α的方法。

背景技术：

1、鹅膏毒肽是一类双环八肽，鹅膏毒肽α(amanitinα)和鹅膏毒肽(amanitinβ)在鹅膏菌中含量最高。针对鹅膏毒肽的检测方法有化学分析技术(如毛细管电泳、薄层层析、高效液相色谱和气相色谱/质谱技术)、分子生物学检验(dna测序和pcr技术)和免疫学方法(抗原抗体法)，但这些方法均因稳定性、灵敏性，或者成本等原因而存在不足。因此，开发简便、快速、有效的毒素检测方法是具有实际和研究意义的工作。

2、核酸适配体是通过体外筛选和扩增而制备得到的单链的dna或rna，它具有很强的识别和结合能力，可以与特定的目标物进行特异性结合。这种经过多轮体外指数富集筛选(systematic evolution ofligands by exponential enrichment，selex)得到的靶标分子-适配体具有合成简单、化学修饰方便、热稳定性强、免疫原性小、几乎无批次间差异、易于保存运输等特点，有望取代抗体。

3、关于靶向鹅膏毒肽α的适配体的研究，已有一些报道，例如文献[1]-[3]均获得了相应的适配体，但是这些报道均无法精确的区分鹅膏毒肽α和鹅膏毒肽β，这是由于鹅膏毒肽α和鹅膏毒肽β的结构相似。

4、另外，cn105177009a也公布了一种能特异性检测α-鹅膏毒肽的适配体，该适配体具有一定的特异性和灵敏度。然而，其进行特异性实验时所选用的阴性对照物质与鹅膏毒肽α差异较大，人们无法得知其是否可以用于区分分鹅膏毒肽α和鹅膏毒肽β。值得指出的是，该专利的适配体的序列全长为79bp，由于序列长度过长会导致空间位阻的增加，不利于适配体与靶标的结合，同时也会提高适配体的合成成本。因此，如何进一步获得序列长度更短的适配体，是亟须的。

5、综上所述，本领域亟须一种能特异性结合鹅膏毒肽α、能准确区分鹅膏毒肽α和鹅膏毒肽β，同时序列长度短的适配体。

6、本部分非专利参考文献：

7、[1]汪颖,乔璞,宋玉竹,张金阳,陈强,韩芹芹.α-鹅膏[蕈]毒环肽核酸适配体的筛选和结构分析[j].中国生物化学与分子生物学报,2016,32(12):1341-1346.doi:10.13865/j.cnki.cjbmb.2016.12.10.

8、[2]muszyńska k,ostrowska d,bartnicki f,kowalska e,bodaszewska-m,hermanowicz p,faulstich h,w.selection and analysis of a dna aptamerbindingα-amanitin from amanita phalloides.acta biochim pol.2017；64(3):401-406.doi:10.18388/abp.2017_1615.epub 2017aug 9.pmid:28787470.

9、[3]张晓萌.基于核酸适配体的生物毒素检测方法建立及应用研究[d].昆明理工大学,2021.doi:10.27200/d.cnki.gkmlu.2021.001730.

技术实现思路

1、针对现有技术的缺陷，本发明的目的之一在于提供一种特异性结合鹅膏毒肽α的适配体，该适配体需能准确区分鹅膏毒肽α和包括鹅膏毒肽β在内的相关物质，具有高特异性；同时，该适配体具有较短的序列长度。

2、为了实现上述目的，本发明提供了一种特异性结合鹅膏毒肽α的适配体，所示适配体的核苷酸序列如seq id no：1所示，长度仅为50bp。该适配体具有发夹结构和茎环结构。

3、适配体的核苷酸序列具体为：

4、tcaagtcattctgacggggtgcttagagcaataggcactgacacgacact

5、本发明的目的之二在于提供所述适配体在制备检测鹅膏毒肽α中的试剂方面的应用。

6、本发明的目的之三在于提供一种非疾病诊断性目的的鹅膏毒肽α的检测方法，所示方法包括如下步骤：

7、(1)将待测样品溶液和适配体溶液混合，之后再加入纳米金粒子进行反应；

8、(2)采用sgi荧光法计算相对荧光强度，当相对荧光强度超过90％时，表明待测样品中含有鹅膏毒肽α；

9、所述适配体为前述核苷酸序列如seq id no：1所示的适配体。

10、作为本发明的一个可实施方案，所述待测样品溶液和适配体溶液均为水溶液。

11、作为本发明的一个可实施方案，所述反应时间为10分钟。

12、作为本发明的一个可实施方案，所述纳米金粒子的制备方法包括如下步骤：

13、避光条件下，将巯基乙胺盐酸盐和haucl4进行搅拌混合，之后在搅拌条件下加入硼氢化钠，继续进行搅拌；然后将所得溶液通过微孔滤膜过滤，收集滤液。

14、优选地，所述纳米金粒子的制备方法为：

15、在避光的条件下，添加浓度为213mm的400μl巯基乙胺盐酸盐和浓度为1.40mm的40ml haucl4到圆底烧瓶中，用磁力搅拌器搅拌二者混合溶液20min；搅拌过程中迅速加入新配置的浓度为10mm)的硼氢化钠溶液10ml，然后再继续搅拌30min，制得酒红色溶液；将上述酒红色溶液通过0.45μm的微孔滤膜，滤液收集在棕色试剂瓶中，冰箱中4℃保存、备用。

16、本发明的发明人在研究的过程中，通过18轮的筛选循环，针对鹅膏毒肽α和鹅膏毒肽β，分别得到31序列和30条序列；之后综合同源性关系和自由能大小，针对鹅膏毒肽α和鹅膏毒肽β分别选定了4，条候选适配体序列：α-30、α-26、α-41、α-61，β-15、β-21、β-65、β-37。如本发明实施例所示，α-30、β-37的亲和力较好，分别为18.26nm、23.32nm。

17、不过，α-30、β-37的序列长度比较大，实际应用前景不佳。为此，发明人对其进行了截短的研究。然而，如本发明的实施例所示，在进行截短之后，很容易出现无法结合或者亲和力更低的问题。通过摸索，发明人意外发现本发明的适配体不仅序列长度可以低至50bp，而且相对于α-30具有更高的亲和力。

18、本发明的有益效果：

19、本发明所得适配体具有高度特异性，可以准确区分鹅膏毒肽α和包括鹅膏毒肽β在内的相关物质；本发明所得适配体的序列长度短，利于适配体与靶标结合，易于合成。

技术特征：

1.一种特异性结合鹅膏毒肽α的适配体，其特征在于，所示适配体的核苷酸序列如seqid no：1所示。

2.根据权利要求1所述的适配体，其特征在于，所述适配体具有发夹结构和茎环结构。

3.权利要求1或2所示的适配体在制备检测鹅膏毒肽α中的试剂方面的应用。

4.一种非疾病诊断性目的的鹅膏毒肽α的检测方法，其特征在于，所示方法包括如下步骤：

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述待测样品溶液和适配体溶液均为水溶液。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述反应时间为10分钟。

7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述纳米金粒子的制备方法包括如下步骤：

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述纳米金粒子的制备方法为：

技术总结
本发明提供了一种特异性结合鹅膏毒肽α的适配体，所示适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，长度仅为50bp，具有发夹结构和茎环结构。本发明所得适配体具有高度特异性，可以准确区分鹅膏毒肽α和包括鹅膏毒肽β在内的相关物质；本发明所得适配体的序列长度短，利于适配体与靶标结合，易于合成。

技术研发人员：杨人香,李娜,苏会岚,阮佳,李东秋,马怡,向怡佳,周杰
受保护的技术使用者：成都医学院
技术研发日：
技术公布日：2024/4/7