一种可用于RNA干扰防治桃蚜的致死基因、RNA干扰序列及其制备方法

本发明属于植物病虫防治领域，特别涉及一种可用于rna干扰防治桃蚜的致死基因、rna干扰序列及其制备方法。

背景技术：

1、桃蚜myzus persicae属半翅目(hemiptera)蚜科(aphididae)，在世界各地广泛分布，是十字花科蔬菜、烟草、辣椒、马铃薯、茄子等数百种作物的主要害虫之一，还可传播多种病毒病，给农业生产造成很大损失。目前桃蚜及其传播的病毒病主要依靠大面积使用农药来防控，给农业生产带来了严重的安全性问题。因此，生产上迫切需要一种安全绿色的防控新技术或策略，能够弥补化学防治弊端。

2、rna干扰(rna interference，rnai)是指由内源或外源的双链rna引发的mrna高效特异性降解，导致特异性阻碍靶标基因表达的现象。根据rna干扰原理，筛选桃蚜的致死基因，通过制备rna干扰制剂，能够安全高效地对桃蚜起到防治作用，是当前发展趋势下解决化学防治问题的良好途径，被誉为新一代害虫防治新技术。该技术是针对桃蚜的特异性基因设计，不会改变桃蚜的基因组，仅对桃蚜具有杀灭效果，具有特异性强、安全性高、致死率高、环境友好等优点，可实现桃蚜的绿色精准防控，能够有效减少化学农药对生态环境的破坏。

技术实现思路

1、为了解决农药防控桃蚜带来的安全性问题，本发明提供了一种可用于rna干扰防治桃蚜的致死基因，可基于该致死基因tret1设计rna干扰序列，高效诱发同源mrna特异性降解，沉默tret1基因在桃蚜体内的表达，最终导致桃蚜繁殖力降低及桃蚜死亡，为利用rna干扰技术控制害虫提供了新途径。

2、本发明还提供了一种用于防治桃蚜的rna干扰序列及其制备方法。

3、本发明通过以下技术方案实现：

4、本发明提供一种可用于rna干扰防治桃蚜的致死基因，所述致死基因包括tret1，所述tret1的cdna的核苷酸序列如seq id no.1所示。

5、基于同一发明构思，本发明还提供一种用于防治桃蚜的rna干扰序列，所述rna干扰序列为根据致死基因tret1合成的dsrna，所述rna干扰序列的核苷酸序列如seq id no.2所示。

6、基于同一发明构思，本发明还提供一种用于防治桃蚜的rna干扰序列的制备方法，包括：

7、克隆桃蚜tret1基因的全长cdna；

8、在tret1基因的全长cdna序列中选取rnai的靶标区域，设计所述rnai的靶标区域的pcr扩增引物tret1-f/tret1-r；

9、提取桃蚜总rna，反转录合成cdna,用所述tret1-f/tret1-r对所述rnai的靶标区域进行pcr扩增，获得目的基因片段，将所述目的基因片段克隆到质粒载体并转化至感受态细胞中，提取质粒；

10、在所述tret1-f/tret1-r的5’端加上t7 promoter序列，获得引物dstret1-f/dstret1-r，以提取的质粒为模板进pcr扩增，获得带t7序列的目的基因，后利用megascriptt7transcription kit合成双链rna，得到用于防治桃蚜的rna干扰序列。

11、进一步的，所述克隆桃蚜tret1基因的全长cdna，具体包括：

12、提取桃蚜总rna，合成cdna；

13、基于桃蚜转录组数据库获得的tret1基因序列设计tret1基因上下游引物tret1-f1/tret1-r1或tret1-f2/tret1-r2，以cdna为模板进行pcr扩增，纯化产物获得桃蚜tret1基因的全长cdna；

14、其中，所述tret1-f1的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述tret1-r1的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述tret1-f2的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述tret1-r2的核苷酸序列如seq id no.6所示。

15、进一步的，所述以cdna为模板进行pcr扩增，纯化产物获得桃蚜tret1基因的全长cdna，具体包括：

16、以cdna为模板进行pcr扩增，pcr反应体系为：premix taq酶12.5μl、cdna模板1μl，正反向引物各1μl、ddh2o 9.5μl，反应程序为：95℃30s；94℃30s，55℃30s，72℃1min，35个循环，72℃10min；

17、将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，纯化回收目的片段，获得桃蚜tret1基因的全长cdna。

18、进一步的，所述tret1-f的核苷酸序列如seq id no.7所示，所述tret1-r的核苷酸序列如seq id no.8所示。

19、进一步的，所述dstret1-f的核苷酸序列如seq id no.9所示，所述dstret1-r的核苷酸序列如seq id no.10所示。

20、基于同一发明构思，本发明还提供一种用于防治桃蚜的rna干扰试剂，包括dsrna与纳米载体，所述dsrna为上述用于防治桃蚜的rna干扰序列，所述dsrna与所述纳米载体的质量比为1:1。

21、基于同一发明构思，本发明还提供一种可用于rna干扰防治桃蚜的致死基因在桃蚜防治中的用途。

22、基于同一发明构思，本发明还提供一种用于防治桃蚜的rna干扰序列在桃蚜防治中的用途。

23、本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

24、1.本发明一种可用于rna干扰防治桃蚜的致死基因，所述致死基因为桃蚜tret1基因，该基因编码海藻糖转运蛋白，可基于该致死基因tret1设计rna干扰序列，诱发同源mrna特异性降解，沉默tret1基因在桃蚜体内的表达，影响桃蚜体内海藻糖的跨细胞膜转运，从而阻断了有机体能量代所需的源料物质，最终导致桃蚜繁殖力降低及桃蚜死亡，为利用rna干扰技术控制害虫提供了新途径。

25、2.本发明一种用于防治桃蚜的rna干扰序列，该rna干扰序列为根据致死基因tret1合成的dsrna，能够高效诱发同源mrna特异性降解，沉默tret1基因在桃蚜体内的表达，最终导致桃蚜繁殖力降低及桃蚜死亡，具有特异性强、安全性高、致死率高、环境友好等优点，有效减少化学农药对生态环境的破坏。

技术特征：

1.一种可用于rna干扰防治桃蚜的致死基因，其特征在于，所述致死基因包括tret1，所述tret1的cdna的核苷酸序列如seq id no.1所示。

2.一种用于防治桃蚜的rna干扰序列，其特征在于，所述rna干扰序列为根据权利要求1所述的致死基因合成的dsrna，所述rna干扰序列的核苷酸序列如seq id no.2所示。

3.一种如权利要求2所述的用于防治桃蚜的rna干扰序列的制备方法，其特征在于，包括：

4.根据权利要求3所述的一种用于防治桃蚜的rna干扰序列的制备方法，其特征在于，所述克隆桃蚜tret1基因的全长cdna，具体包括：

5.根据权利要求4所述的一种用于防治桃蚜的rna干扰序列的制备方法，其特征在于，所述以cdna为模板进行pcr扩增，纯化产物获得桃蚜tret1基因的全长cdna，具体包括：

6.根据权利要求3所述的一种用于防治桃蚜的rna干扰序列的制备方法，其特征在于，所述tret1-f的核苷酸序列如seq id no.7所示，所述tret1-r的核苷酸序列如seq id no.8所示。

7.根据权利要求3所述的一种用于防治桃蚜的rna干扰序列的制备方法，其特征在于，所述dstret1-f的核苷酸序列如seq id no.9所示，所述dstret1-r的核苷酸序列如seq idno.10所示。

8.一种用于防治桃蚜的rna干扰试剂，其特征在于，包括dsrna与纳米载体，所述dsrna为如权利要求2所述的用于防治桃蚜的rna干扰序列，所述dsrna与所述纳米载体的质量比为1:1。

9.如权利要求1所述的一种可用于rna干扰防治桃蚜的致死基因在桃蚜防治中的用途。

10.如权利要求2所述的一种用于防治桃蚜的rna干扰序列在桃蚜防治中的用途。

技术总结
本发明提供了一种可用于RNA干扰防治桃蚜的致死基因，属于植物病虫防治领域，所述致死基因包括Tret1，所述Tret1的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。可基于该致死基因Tret1设计RNA干扰序列，高效诱发同源mRNA特异性降解，沉默Tret1基因在桃蚜体内的表达，最终导致桃蚜繁殖力降低及桃蚜死亡，为利用RNA干扰技术控制害虫提供了新途径。本发明还提供一种用于防治桃蚜的RNA干扰序列及其制备方法。

技术研发人员：张长禹,杨昌利,孟建玉
受保护的技术使用者：贵州大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15