罗汉果糖基转移酶突变体R192A及其构建方法与应用与流程

本发明涉及基因工程和酶工程，更具体的说是涉及罗汉果糖基转移酶突变体r192a及其构建方法与应用。

背景技术：

1、罗汉果苷是传统中药罗汉果的主要活性成分，还是非糖类纯天然甜味剂。药理学研究表明罗汉果苷具有镇咳祛痰、润肺保肝、抗炎、抗癌、降血糖等作用。此外，罗汉果苷已成为为数不多的从中药中发掘出来的具有治疗功能的新型甜味剂。罗汉果苷是一类以罗汉果醇为苷元的葫芦烷型三萜皂苷，连接多样的葡萄糖基团后形成的一系列罗汉果苷类化合物。罗汉果苷的甜味与糖基的数量和连接方式相关，苷元罗汉果醇的3位和24位连接的葡萄糖残基总数为4～6个葡萄糖时形成具有高强度甜味的罗汉果甜苷ⅳ、ⅳa、ⅴ、ⅵ，以及赛门苷ⅰ等。

2、现研究发现，罗汉果糖基转移酶sgugt94-289-3具有底物杂泛性、体外催化活性低等问题，阻碍了其在工业化生产中的应用。

3、综上，如何提供一种酶活性高、底物专一性高、可满足工业化生产罗汉果甜苷的糖基转移酶是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了罗汉果糖基转移酶突变体r192a及其构建方法与应用。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种罗汉果糖基转移酶突变体r192a，其氨基酸序列如seq id no.1所示。

4、mdaaqqgdtttilmlpwlgyghlsaflelakslsrrnfhiyfcstsvnldaikpklpssfsdsiqfvelhlpsspefpphlhttnglpptlmpalhqafsmaaqhfesilqtlaphlliydslqpwaprvasslkipainfnttgvfvisqglhpihyphskfpfsefvlhnhwkamystadgastertrkageaflyclhascsvilinsfrelegkymdylsvllnkkvvpvgplvyepnqdgedegyssiknwldkkepsstvfvsfgseyfpskeemeeiahgleasevnfiwvvrfpqgdntsgiedalpkgfleragergmvvkgwapqakilkhwstggfvshcgwnsvmesmmfgvpiigvpmhvdqpfnaglveeagvgveakrdpdgkiqrdevaklikevvvektredvrkkaremseilrskgeekfdemvaeislllki，seq id no.1。

5、对所述罗汉果糖基转移酶突变体r192a的其他氨基酸位点的保守取代形式、增加或缺失一个或几个氨基酸的形式、氨基端截断的形式、羧基端截断的形式，这些突变体也包括在本发明的保护范围内。

6、进一步的，通过将罗汉果糖基转移酶sgugt94-289-3编码的氨基酸序列的第192位进行点突变，将精氨酸置换为丙氨酸得到；

7、所述罗汉果糖基转移酶sgugt94-289-3编码的氨基酸序列如seq id no.2所示。

8、mdaaqqgdtttilmlpwlgyghlsaflelakslsrrnfhiyfcstsvnldaikpklpssfsdsiqfvelhlpsspefpphlhttnglpptlmpalhqafsmaaqhfesilqtlaphlliydslqpwaprvasslkipainfnttgvfvisqglhpihyphskfpfsefvlhnhwkamystadgastertrkrgeaflyclhascsvilinsfrelegkymdylsvllnkkvvpvgplvyepnqdgedegyssiknwldkkepsstvfvsfgseyfpskeemeeiahgleasevnfiwvvrfpqgdntsgiedalpkgfleragergmvvkgwapqakilkhwstggfvshcgwnsvmesmmfgvpiigvpmhvdqpfnaglveeagvgveakrdpdgkiqrdevaklikevvvektredvrkkaremseilrskgeekfdemvaeislllki，seq id no.2。

9、编码上述罗汉果糖基转移酶突变体r192a的基因，核苷酸序列如seq id no.3所示。

10、atggatgctgcccaacaaggtgacaccacaaccattttgatgcttccatggctcggctatggccatctttcagcttttctcgagctggccaaaagcctctcaaggaggaacttccatatctacttctgttcaacctctgttaatcttgacgccattaaaccaaagcttccttcttctttctctgattccattcaatttgtggagctccatctcccttcttctcctgagttccctcctcatcttcacacaaccaacggccttccccctaccctcatgcccgctctccaccaagccttctccatggctgcccagcactttgagtccattttacaaacacttgccccgcaccttctcatttatgactctcttcaaccttgggctcctcgggtagcttcatccctcaaaattccggccatcaacttcaataccacgggagttttcgtcatttctcaagggcttcaccctattcactacccacattctaaattcccattctcagagttcgttcttcacaatcattggaaagccatgtactccactgccgatggagcttctaccgaaagaacccgcaaagcgggagaagcgtttctgtattgcttgcatgcttcttgtagtgtaattctaatcaatagtttcagagagctcgaggggaaatatatggattatctctctgttctcttgaacaagaaagttgttccggttggtcctttggtttacgaaccgaatcaagacggggaagatgaaggttattcaagcatcaaaaattggcttgacaaaaaggaaccgtcctccaccgtcttcgtgtcatttggaagcgaatacttcccgtcaaaggaagaaatggaagagatagcccatgggttagaggcgagcgaggttaatttcatctgggtcgttaggtttcctcaaggagacaacaccagcggcattgaagatgccttgccgaagggttttctggagagggcgggagagagagggatggtggtgaagggttgggctcctcaggcgaagatactgaagcattggagcacagggggattcgtgagccactgtggatggaactcggtgatggagagcatgatgtttggcgttcccataataggggttccgatgcatgtggaccagccctttaacgccggactcgtggaagaagctggcgtcggcgtggaggccaagcgagatccagacggcaaaattcaaagagacgaagttgcaaagttgatcaaagaagtggtggttgagaaaaccagagaagatgtgcggaagaaagcaagagaaatgagtgagattttgaggagcaagggagaggagaagtttgatgagatggtcgctgaaatttctctcttgcttaaaata，seqid no.3。

11、包含上述基因的表达载体。

12、进一步的，原始载体为pet28a质粒。

13、转化了上述表达载体的微生物。

14、进一步的，所述微生物为大肠杆菌rosetta(de3)。

15、上述的罗汉果糖基转移酶突变体r192a在合成罗汉果苷中的应用。

16、进一步的，所述罗汉果苷为罗汉果苷ⅴ。

17、上述的罗汉果糖基转移酶突变体r192a的构建方法，包括如下步骤：

18、(1)使用含点突变位点的引物，以罗汉果糖基转移酶sgugt94-289-3的基因为模板，pcr扩增突变体基因；

19、所述引物的核苷酸序列如下：

20、r192a-f：gcttctaccgaaagaacccgcaaagcgggagaagcgtt tctgtattgcttgc，seq idno.4；

21、r192a-r：gcaagcaatacagaaacgcttctcccgctttgcgggttc tttcggtagaagc，seq idno.5；

22、罗汉果糖基转移酶sgugt94-289-3的基因的核苷酸序列如seq id no.6所示；

23、atggatgctgcccaacaaggtgacaccacaaccattttgatgcttccatggctcggctatggccatctttcagcttttctcgagctggccaaaagcctctcaaggaggaacttccatatctacttctgttcaacctctgttaatcttgacgccattaaaccaaagcttccttcttctttctctgattccattcaatttgtggagctccatctcccttcttctcctgagttccctcctcatcttcacacaaccaacggccttccccctaccctcatgcccgctctccaccaagccttctccatggctgcccagcactttgagtccattttacaaacacttgccccgcaccttctcatttatgactctcttcaaccttgggctcctcgggtagcttcatccctcaaaattccggccatcaacttcaataccacgggagttttcgtcatttctcaagggcttcaccctattcactacccacattctaaattcccattctcagagttcgttcttcacaatcattggaaagccatgtactccactgccgatggagcttctaccgaaagaacccgcaaacgtggagaagcgtttctgtattgcttgcatgcttcttgtagtgtaattctaatcaatagtttcagagagctcgaggggaaatatatggattatctctctgttctcttgaacaagaaagttgttccggttggtcctttggtttacgaaccgaatcaagacggggaagatgaaggttattcaagcatcaaaaattggcttgacaaaaaggaaccgtcctccaccgtcttcgtgtcatttggaagcgaatacttcccgtcaaaggaagaaatggaagagatagcccatgggttagaggcgagcgaggttaatttcatctgggtcgttaggtttcctcaaggagacaacaccagcggcattgaagatgccttgccgaagggttttctggagagggcgggagagagagggatggtggtgaagggttgggctcctcaggcgaagatactgaagcattggagcacagggggattcgtgagccactgtggatggaactcggtgatggagagcatgatgtttggcgttcccataataggggttccgatgcatgtggaccagccctttaacgccggactcgtggaagaagctggcgtcggcgtggaggccaagcgagatccagacggcaaaattcaaagagacgaagttgcaaagttgatcaaagaagtggtggttgagaaaaccagagaagatgtgcggaagaaagcaagagaaatgagtgagattttgaggagcaagggagaggagaagtttgatgagatggtcgctgaaatttctctcttgcttaaaata，seqid no.6。

24、(2)将所述突变体基因连接到pet28a载体，得到重组质粒；

25、(3)罗汉果糖基转移酶突变体r192a的表达和纯化。

26、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：本发明将野生型罗汉果糖基转移酶sgugt94-289-3的氨基酸序列的192位点处的氨基酸进行点突变，将精氨酸置换为丙氨酸，从而获得罗汉果糖基转移酶突变体r192a。研究证明，该突变体催化底物罗汉果苷ⅳa合成罗汉果苷ⅴ的活性和生物合成效率显著提高，产物罗汉果苷ⅴ的相对产率较野生型提升了5倍，可满足在工业化生产中的应用，具有重要的应用价值。