DNA探针杂交结合S1核酸酶消化分析tRNA中第58位m1A修饰的分析方法

本发明属于生物，涉及一种dna探针杂交结合s1核酸酶消化分析trna中第58位m1a修饰的分析方法。

背景技术：

1、rna中除了四种正常核苷：腺嘌呤核苷(a)、鸟嘌呤核苷(g)、尿嘧啶核苷(u)、胞嘧啶核苷(c)外，还包含丰富多样的修饰核苷。迄今为止，已在rna中鉴定出150多种具有重要功能的表观遗传学修饰。腺嘌呤n1位置上发生的甲基化(m1a)是一种重要的腺苷甲基化修饰，广泛存在于mrna、rrna和trna中。

2、trna中含有丰富的m1a修饰。哺乳动物trna中的m1a主要位于保守tψc loop环上的第58位，由trna甲基转移酶复合物trmt6/61a催化形成。哺乳动物trna第58位的m1a是一种可逆的甲基化修饰，由去甲基化酶alkbh1、alkbh3和fto催化去甲基。trna中第58位的m1a对trna的稳定性至关重要。alkbh1介导的trna中第58位m1a的去甲基化会影响trnaimet的稳定性从而影响翻译起始和翻译延伸，揭示了trna的可逆甲基化作为转录后基因表达调控的新机制。alkbh3介导的trna中第58位m1a的去甲基化通过产生trna衍生的小rna促进癌症的发展。尽管trna中第58位m1a在调控基因表达和癌症发生发展方面有重要功能，但具体生理过程中第58位m1a修饰的动态变化尚不清楚。除了了解trna中m1a修饰的位点外，准确定量特定位点的m1a修饰是深入了解其生物学功能的基础。

3、因此，有必要开发一种能应用于特定rna修饰位点的定量分析中，无需高通量测序，无需复杂的计算，具有高灵敏度、高选择性、操作简便的质谱分析方法。

技术实现思路

1、为了解决所述技术问题，本发明提供了一种dna探针杂交结合s1核酸酶消化分析trna中第58位m1a修饰的分析方法，该方法原理直接、操作简便，无需高通量测序，可以直接获得trna中第58位m1a修饰的定量信息。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、在本发明的第一方面，提供了一种dna探针杂交结合s1核酸酶消化分析trna中第58位m1a修饰的分析方法，所述方法包括：

4、使用生物素标记的dna探针与trna中含有第58位m1a修饰的寡核苷酸片段进行退火杂交；其中，所述生物素标记的dna探针与所述寡核苷酸片段的碱基互补配对；

5、采用s1核酸酶对上述trna中未杂交的区域进行消化，获得含有第58位m1a修饰的rna/dna杂合体；

6、提取所述含有第58位m1a修饰的rna/dna杂合体，并对所述trna中第58位m1a修饰进行定量分析。

7、上述技术方案中，所述trna为从生物样品组织或细胞中提取的特定类型trna(样品量根据待测trna样品中m1a修饰的水平确定)。

8、生物素标记的dna探针中，所述生物素标记在所述dna探针的5’端。

9、进一步地，所述退火杂交的反应体系包括45～55mm tris-hcl(ph 7.0)、3～7mmmgcl2、3～7μm所述生物素标记的dna探针和3～7μm所述寡核苷酸片段。优选地，所述退火杂交的反应体系包括50mm tris-hcl(ph 7.0)、5mm mgcl2、5μm所述生物素标记的dna探针和5μm所述寡核苷酸片段。

10、进一步地，所述采用s1核酸酶的消化反应的条件为：反应温度为22-24℃，反应时间为10-30min。

11、进一步地，所述采用s1核酸酶的消化反应体系包括：1×s1 nuclease buffer、s1核酸酶。

12、进一步地，所述提取采用链霉亲和素磁珠提取。

13、进一步地，所述定量分析的方法具体包括：

14、配置系列浓度的标准品溶液，通过分析物的峰面积比相对于分析物的浓度构建标准曲线；

15、将所述含有第58位m1a修饰的rna/dna杂合体通过液相色谱-质谱联用技术分析得到的峰面积比带入所述标准工作曲线，得到样品trna中第58位m1a修饰的定量结果。

16、进一步地，所述定量分析中标准曲线方程为：y＝0.2763x+0.00864，其中x为修饰核苷m1a与正常核苷g的浓度比值，y为通过液相色谱-质谱获得的峰面积比(修饰核苷m1a/正常核苷g)。

17、本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

18、本发明提供的dna探针杂交结合s1核酸酶消化分析trna中第58位m1a修饰的分析方法，通过dna探针杂交结合s1核酸酶消化获得含有第58位m1a修饰的rna/dna杂合体，通过质谱分析获得trna中第58位m1a修饰的定量信息。

19、本发明提供的分析方法的实验原理直接，方法简便，无需复杂的实验操作。无需高通量测序，简化了分析流程，缩短了实验周期。采用质谱作为检测手段，增加了方法的灵敏度，利于低浓度m1a修饰的分析。不涉及复杂的计算，利于trna中第58位m1a修饰的定量分析。

技术特征：

1.一种dna探针杂交结合s1核酸酶消化分析trna中第58位m1a修饰的分析方法，其特征在于，所述方法包括：

2.根据权利要求1所述的dna探针杂交结合s1核酸酶消化分析trna中第58位m1a修饰的分析方法，其特征在于，所述退火杂交的反应体系包括45～55mm tris-hcl、3～7mm mgcl2、3～7μm所述生物素标记的dna探针和3～7μm所述寡核苷酸片段。

3.根据权利要求1所述的dna探针杂交结合s1核酸酶消化分析trna中第58位m1a修饰的分析方法，其特征在于，所述采用s1核酸酶的消化反应的条件为：反应温度为22～24℃，反应时间为10～30min。

4.根据权利要求1所述的dna探针杂交结合s1核酸酶消化分析trna中第58位m1a修饰的分析方法，其特征在于，所述采用s1核酸酶的消化反应体系包括：1×s1 nuclease buffer和s1核酸酶。

5.根据权利要求1所述的dna探针杂交结合s1核酸酶消化分析trna中第58位m1a修饰的分析方法，其特征在于，所述提取所述含有第58位m1a修饰的rna/dna杂合体中采用链霉亲和素磁珠进行提取。

6.根据权利要求1所述的dna探针杂交结合s1核酸酶消化分析trna中第58位m1a修饰的分析方法，其特征在于，所述定量分析包括：通过液相色谱-质谱联用技术用于trna中第58位m1a修饰的定量分析。

7.根据权利要求6所述的dna探针杂交结合s1核酸酶消化分析trna中第58位m1a修饰的分析方法，其特征在于，所述定量分析的方法具体包括：

8.根据权利要求7所述的dna探针杂交结合s1核酸酶消化分析trna中第58位m1a修饰的分析方法，其特征在于，所述定量分析中标准曲线方程为：y＝0.2763x+0.00864，其中x为修饰核苷m1a与正常核苷g的浓度比值，y为通过液相色谱-质谱获得的修饰核苷m1a/正常核苷g的峰面积比。

技术总结
本发明提供了一种DNA探针杂交结合S1核酸酶消化分析tRNA中第58位m<supgt;1</supgt;A修饰的分析方法，所述构建方法包括使用生物素标记的DNA探针与tRNA中含有第58位m<supgt;1</supgt;A修饰的寡核苷酸片段进行退火杂交；其中，所述生物素标记的DNA探针与所述寡核苷酸片段的碱基互补配对；采用S1核酸酶对上述tRNA中未杂交的区域进行消化，获得含有第58位m<supgt;1</supgt;A修饰的RNA/DNA杂合体；提取所述含有第58位m<supgt;1</supgt;A修饰的RNA/DNA杂合体，并对所述tRNA中第58位m<supgt;1</supgt;A修饰进行定量分析。该方法原理直接、操作简便，无需高通量测序，可以直接获得tRNA中第58位m<supgt;1</supgt;A修饰的定量信息。

技术研发人员：袁必锋,游雪娇
受保护的技术使用者：武汉大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14