检测支气管败血波氏杆菌的环介导等温扩增引物组及试剂盒的制作方法

本发明涉及体外检测，具体涉及检测支气管败血波氏杆菌的环介导等温扩增引物组及试剂盒。

背景技术：

1、支气管败血波氏杆菌(bordetella bronchiseptica)又称为支气管炎博德特氏菌，是一种需氧革兰氏阴性菌，可引起多种哺乳动物呼吸道的隐性感染及急、慢性炎症，如猪、犬、猫、马、牛、兔、鼠等动物。临床症状包括打喷嚏、眼睛出现分泌物(黄绿色)、鼻腔出现分泌物(黄绿色)、咳嗽(不是很常见)，不太常见的临床症状包括肺脏呼吸音增强、淋巴结肿大、发热、肺炎、呼吸困难等。在猫中，10周龄以下的仔猫和老年猫发病率更高一些。早期快速诊断感染能够及时指导临床治疗，为合理选择抗细菌药物提供依据并在防止抗生素滥用方面具有重要意义。

2、当前已建立了多种支气管败血波氏杆菌检测方法，主要包括采用传统培养基法(病原微生物分离鉴定、形态学鉴定及自动化鉴定方法)、酶联免疫技术、核酸探针技术、核酸扩增(pcr)技术等，但都存在不足，如电镜方法复杂昂贵，细菌分离培养耗时极长且假阳性较多，在拿到培养结果后通常已失去临床意义。pcr检测法近年来在临床检测中应用颇多，如常规pcr、实时荧光定量pcr等，在病原微生物的检测以及疾病诊断方面作用重大，但其一般需要能够进行精密控温的仪器来进行高级复杂的分析，并且对检测人员的操作要求较高，反应时间较长，不适用于样品的现场检测，不利于基层推广，无法满足疾病防控简单、快速、准确的检测要求。

3、环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,lamp)通过识别靶序列上6个特异区域的引物，在一种具有链置换特性的dna聚合酶——bst酶(bst dnapolymerase)的作用下，能够在恒温条件下高效、快速、特异地扩增dna靶序列。在lamp体系中加入荧光染料，可根据反应体系中的荧光信号强度来判断反应的进行情况。目前，lamp技术已经被广泛应用于病原微生物的检测中，包括人类致病微生物、动植物病毒以及寄生虫所致疾病的诊断。因此利用环介导等温扩增技术来检测动物体中的支气管败血波氏杆菌对于动物医学的临床诊断具有重要的意义。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供检测支气管败血波氏杆菌的环介导等温扩增引物组及试剂盒。本发明提供的三对特异性环介导等温扩增引物主要用于检测各种标本中的支气管败血波氏杆菌，包括外引物、内引物和环引物，该引物组扩增效率良好，能够实现快速检测。

2、本发明提供了以seq id no：1所示的核酸序列为标志物，在制备检测支气管败血波氏杆菌(bordetella bronchiseptica)的环介导等温扩增引物中的应用。

3、本发明通过试验发现，相对于其他片段，seq id no：1所示的核酸序列作为标志物时，检测效果更好，特异性和灵敏度高于其他核酸序列。基于此，对seq id no：1所示的核酸序列进行特异性分析发现，该核酸序列保守性更强(如图1所示)，能够特异性检测支气管败血波氏杆菌。本发明对检测支气管败血波氏杆菌的环介导等温扩增引物组的序列不做限制，任何利用seq id no：1所示的核酸序列作为标志物设计的引物序列都在本发明的保护范围之内。

4、本发明提供了检测支气管败血波氏杆菌(bordetella bronchiseptica)的环介导等温扩增引物组，包括一对外引物f3和b3、一对内引物fip和bip和一对环引物lf和lb；

5、所述外引物对中两条引物的核酸序列分别如seq id no：2或3所示；

6、所述内引物对中两条引物的核酸序列分别如seq id no：4或5所示；

7、所述环引物对中两条引物的核酸序列分别如seq id no：6或7所示。

8、本发明基于标志物设计了三组引物，通过对引物组的性能分析测试筛选出检测效果更好的引物组。实验结果表明，本发明所述的三对引物检测样本中的支气管败血波氏杆菌时，效果比其他引物组好，灵敏度更高，特异性更好，反应进程更快，能够极大地缩短反应时间。

9、在本发明的实施例中，本发明提供的三对引物能检测出来低浓度的支气管败血波氏杆菌质粒dna；并且在30min内的最低检出限为1个拷贝的目标核酸，说明本发明所述的引物组具有较高的灵敏度。检测含有其他病毒或支原体的样本时，荧光值趋近于零，说明本发明所述的引物组具有良好的特异性。且本发明所述引物组的检测结果不受样本种类的干扰，具有较高的准确性。利用本发明所述的引物组对临床样本进行测试，检测结果准确度为100％。

10、本发明提供了所述的引物组在制备检测支气管败血波氏杆菌的试剂或试剂盒中的应用。

11、本发明还提供了检测支气管败血波氏杆菌的试剂盒，其包括本发明所述的引物组。

12、具体的，所述试剂盒中的引物f3、b3、fip、bip、lf和lb的摩尔比为(0.1～1)：(0.1～5)：(0.1～5)：(0.1～5)：(0.1～3)：(0.1～3)。

13、在一些实施例中，所述试剂盒中的引物f3、b3、fip、bip、lf和lb的摩尔比为(0.3～0.5)：(1～2)：(2.4～3.4)：(2.4～3.4)：(1～2)：(1～2)。

14、进一步的，本发明所述的试剂盒还包括缓冲液、dna聚合酶和荧光染料eva-green。

15、具体的，所述缓冲液的浓度为1x，dna聚合酶的浓度为0.1～0.5u/μl，荧光染料eva-green的浓度为0.1～3μm。

16、在一些实施例中，本发明所述的试剂盒包括0.3μmol/l f3、2μmol/l b3、2.4μmol/l fip、2.4μmol/l bip、1μmol/l lf、1μmol/l lb、1x缓冲液、0.2u/μldna聚合酶和0.6μm荧光染料eva-green。

17、所述试剂盒在检测支气管败血波氏杆菌时的反应条件为60～65℃，检测模板的灵敏度为1copy/ul。

18、本发明还提供了检测支气管败血波氏杆菌的方法，其包括利用本发明所述的试剂盒对样本进行检测。

19、本发明提供的方法可为诊断目的的，也可为非诊断目的的。例如，包括对人体或动物体，或者离体的来自于人体或动物体的样品进行的以诊断为目的的检测方法；也包括对环境样品或者模拟样品进行的以科研或其他非诊断目的检测方法。

20、利用本发明提供的检测支气管败血波氏杆菌的环介导等温扩增引物组或其试剂盒，能够在30分钟内检测出1个拷贝的病毒核酸，极大地加速了反应进程，缩短了反应时间；本发明在三对特异性引物的基础上建立的披衣菌检测方法具有准确性高、灵敏度高、特异性强的特点。

21、本发明提供的支气管败血波氏杆菌检测方法中加入了荧光染料eva-green，该染料在反应配置时加入，反应过程中能够通过采集的荧光值变化来检测反应情况，无需开盖，极大地降低了污染的可能性，减少了假阳性的发生。