一种猕猴桃果实抗坏血酸含量的调控机制及其应用

本发明属于植物分子生物技术和基因工程领域，具体而言，涉及一种猕猴桃果实抗坏血酸含量的调控机制及其应用。

背景技术：

1、抗坏血酸(ascorbic acid,asa)即维生素c，广泛存在于植物组织中的天然抗氧化剂，对植物的生长发育及果实品质的形成具有重要作用，是维持人类正常生长发育所必需的营养物质。人类及一些灵长类动物由于最后一个asa合成酶的突变，致使自身无法合成asa，必须从果实、蔬菜等食物中摄取。鉴于asa在生物体内的重要功能，提高植物尤其是蔬菜和水果中asa的含量的研究具有重要的产业意义和应用价值。

2、猕猴桃是猕猴桃科猕猴桃属中多年生落叶藤本植物之一，又称毛木果、麻藤果、奇异果等。猕猴桃果实富含asa，其含量是梨和苹果的80-100倍，高asa代谢积累成为猕猴桃果实营养物质的研究热点，猕猴桃果实也成为研究asa代谢的模式植物。

3、本课题组研究发现，猕猴桃果实内外果皮asa含量存在显著差异，内果皮asa含量显著大于外果皮，然而内外果皮asa差异的生理和分子机制尚不清楚。因此还需探究猕猴桃内外果皮asa代谢差异的原因，希望能够揭示猕猴桃果实asa代谢生理和分子机制，期待丰富asa生物合成调控途径和提高果实asa含量提供理论基础，从而实现对猕猴桃果实抗坏血酸含量的调控。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供了一种猕猴桃果实抗坏血酸含量的调控机制及其应用，通过探究猕猴桃果实内外果皮asa差异的机理，发现一系列造成猕猴桃果实内外果皮asa含量差异的基因，包括7个asa合成途径的基因和3个asa循环途径的基因；同时通过microrna组学测定与分析，比较猕猴桃果实内外果皮中的差异表达的mirna，发现mir156表达水平与asa含量正相关，可能是调控猕猴桃果实内外果皮asa含量差异的关键mirna；瞬时过表达或干扰表达mir156，可相应调控猕猴桃果实7个asa合成途径的基因和3个asa循环途径的基因的表达，从而调控猕猴桃果实的asa含量。

2、本发明所述猕猴桃内果皮是指猕猴桃果实中靠近中心处的果肉，其中心呈黄色，周围有红色果肉；猕猴桃外果皮是指包裹内果皮的外层果肉，呈翠绿色(图1)。

3、本发明经研究表明，猕猴桃果实内外果皮asa含量存在显著差异，果实内果皮中asa(还原性asa)和t-asa(总抗坏血酸，包括还原性和氧化性asa)含量显著高于外果皮，而且在猕猴桃果实发育过程中抗坏血酸含量逐渐降低，然而内外果皮asa差异的生理和分子机制还需要进一步研究探索。于是，本发明通过生理生化以及分子互作调控手段，探究猕猴桃内外果皮asa代谢差异的原因，以此来揭示猕猴桃果实asa代谢生理和分子机制，期待丰富asa生物合成调控途径和提高果实asa含量提供理论基础。

4、l-半乳糖途径是猕猴桃果实asa合成的主要途径。本发明利用实时荧光定量pcr技术，分析asa合成途径相关基因表达水平，发现acpgi、acpmm、acgmp、acgpp、acgaildh、acgme、acgaiur是导致猕猴桃果实内外果皮asa差异的主要基因，且主要存在于果实发育早期。

5、为了进一步探索猕猴桃内外果皮asa含量差异机制，本发明还分析了asa循环和降解途径相关基因表达水平，发现在asa循环途径中，acmdhar2、acdhar、acgr是导致猕猴桃果实内外果皮asa差异的主要基因，主要存在于果实发育后期，asa讲解途径未见明显差异的基因。

6、因此，本课题组研究表明，造成猕猴桃果实内外果皮asa差异的基因，包括7个asa合成途径的基因：acpgi、acpmm、acgmp、acgpp、acgaildh、acgme、acgaiur，和3个asa循环途径的基因：acmdhar2、acdhar、acgr。

7、为了找到调控猕猴桃果实asa含量的方法，通过microrna组学研究，比较高asa含量的猕猴桃果实样品与低asa含量的猕猴桃果实样品中的基因表达差异，找到能用于调控猕猴桃果实asa含量的基因mir156；本发明提供了如下的技术方案：

8、一方面，本发明提供了mir156基因用于制备提高和/或降低猕猴桃的抗坏血酸含量的制剂的用途，所述mir156基因具有如序列表seq id no.1所示的核苷酸序列。

9、进一步地，本发明通过促进mir156基因的表达来提高猕猴桃的抗坏血酸含量；通过降低mir156基因的表达来降低猕猴桃的抗坏血酸含量。

10、进一步地，所述促进mir156基因的表达，能够促进acpgi、acpmm、acgmp、acgpp、acgaildh、acgme、acgaiur、acmdhar2、acdhar、acgr中的任意一种或多种基因的表达从而提高猕猴桃的抗坏血酸含量；所述降低mir156基因的表达能够降低acpgi、acpmm、acgmp、acgpp、acgaildh、acgme、acgaiur、acmdhar2、acdhar、acgr中的任意一种或多种基因的表达从而降低猕猴桃的抗坏血酸含量；所述acpgi、acpmm、acgmp、acgpp、acgaildh、acgme、acgaiur、acmdhar2、acdhar、acgr具有如序列表seq id no.2～11所示的核苷酸序列。

11、另一方面，本发明提供了mir156基因用于制备提高和/或降低果实中的acpgi、acpmm、acgmp、acgpp、acgaildh、acgme、acgaiur、acmdhar2、acdhar、acgr中的任意一种或多种基因表达的制剂的用途；所述acpgi、acpmm、acgmp、acgpp、acgaildh、acgme、acgaiur、acmdhar2、acdhar、acgr具有如序列表seq id no.2～11所示的核苷酸序列。

12、进一步地，所述果实包括猕猴桃。

13、再一方面，本发明提供了一种mir156基因过表达载体用于制备提高猕猴桃的抗坏血酸含量的制剂的用途，所述mir156基因过表达载体具有如seq id no.1所示的核苷酸序列。

14、通过构建mir156过表达载体，过表达mir156，可相应促进7个asa合成途径的基因(acpgi、acpmm、acgmp、acgpp、acgaildh、acgme、acgaiur)和3个asa循环途径的基因(acmdhar2、acdhar、acgr)的表达，从而提高猕猴桃果实的asa含量。

15、再一方面，本发明提供了一种mir156基因干扰表达载体用于制备降低猕猴桃的抗坏血酸含量的制剂的用途，所述mir156基因干扰表达载体具有如seq id no.17所示的核苷酸序列。

16、通过构建mir156干扰表达载体，干扰表达mir156，可相应抑制7个asa合成途径的基因(acpgi、acpmm、acgmp、acgpp、acgaildh、acgme、acgaiur)和3个asa循环途径的基因(acmdhar2、acdhar、acgr)的表达，从而降低猕猴桃果实的asa含量。

17、再一方面，本发明提供了一种用于提高猕猴桃的抗坏血酸含量的制剂，所述制剂包括mir156基因的过表达载体。

18、进一步地，所述mir156基因过表达载体含有如seq id no.1所示的核苷酸序列。

19、再一方面，本发明提供了一种用于降低猕猴桃的抗坏血酸含量的制剂，所述制剂包括mir156基因的干扰表达载体。

20、进一步地，所述mir156基因干扰表达载体含有如seq id no.17所示的核苷酸序列。

21、再一方面，本发明提供了一种提高猕猴桃的抗坏血酸含量的方法，所述方法通过在猕猴挑上施用如上所述的包括mir156基因的过表达载体的制剂。

22、再一方面，本发明提供了一种降低猕猴桃的抗坏血酸含量的方法，所述方法通过在猕猴挑上施用如上所述的包括mir156基因的干扰表达载体的制剂。

23、再一方面，本发明提供了一种标志物用于制备预测果实中抗坏血酸含量的制剂的用途，所述标志物包括mir156、acpgi、acpmm、acgmp、acgpp、acgaildh、acgme、acgaiur、acmdhar2、acdhar、acgr中的任意一种或多种基因，所述mir156、acpgi、acpmm、acgmp、acgpp、acgaildh、acgme、acgaiur、acmdhar2、acdhar、acgr分别具有如序列表seq id no.1～11所示的核苷酸序列。

24、本发明的有益效果为：

25、1、发现猕猴桃果实内外果皮asa水平存在明显差异，并发现7个asa合成途径的基因(acpgi、acpmm、acgmp、acgpp、acgaildh、acgme、acgaiur)和3个asa循环途径的基因(acmdhar2、acdhar、acgr)，是导致猕猴桃果实内外果皮asa水平差异的重要原因；

26、2、通过microrna组学研究，找到能用于调控猕猴桃果实asa含量的基因mir156；

27、3、通过构建mir156过表达载体实现mir156的过表达，可相应促进7个asa合成途径的基因和3个asa循环途径的基因的表达，从而提高猕猴桃果实的asa含量；

28、4、通过构建mir156干扰表达载体实现mir156的干扰表达，可相应抑制7个asa合成途径的基因和3个asa循环途径的基因的表达，从而降低猕猴桃果实的asa含量。