一种D-果糖及稀少糖的高通量检测方法

本发明涉及一种d-果糖及稀少糖的高通量检测方法，属于生物。

背景技术：

1、在碳水化合物研究领域中，稀少糖是一类重要的研究内容。国际糖协会(isrs)对稀少糖的定义为：在自然界中存在但含量极少的一类单糖及其衍生物。尽管在自然界中含量极少，这些物质却在膳食、保健、医药等领域中发挥着非常重要的功能。例如，d-阿洛酮糖是一种低能量、不被人体消化的蔗糖替代品；d-塔格糖具有低热量、低吸收、抗龋齿、降血糖、改善肠道菌群及良好的理化性质等优点；d-阿洛糖具有抑制活性氧、抑制癌细胞增殖等功能；l-系列糖可以作为各种化学产品、药品的生产原料。

2、随着全球肥胖患者的不断增加，人们对低卡路里甜味剂的重视与需求与日俱增，天然健康的稀少糖作为一种低卡路里甜味剂已成为当下的研究热点。目前已工业制备的稀少糖主要有d-阿洛酮糖、d-塔格糖等。

3、d-阿洛酮糖是d-果糖c-3位的差向异构体，它是一种六碳还原性酮糖。d-阿洛酮糖的甜度相当于蔗糖的70％，但热量仅为0.4kcal·g-1，比蔗糖低了90％。美国食品药品监督管理局(food and drug administration,fda)2014年6月发布认证，认定d-阿洛酮糖为“一般认定安全”(generally recognized as safe,gras)级别食品，2019年又将d-阿洛酮糖从食品营养和添加剂标签上“总糖”和“添加糖”部分中剔除，因此d-阿洛酮糖是一种潜在的蔗糖替代品。d-阿洛酮糖与糖醇相比入口无涩味且不会引发腹泻等不耐受症状，与其他大多数现有甜味剂相比，性质稳定且在食品制备与加热过程中与食物中的氨基酸和蛋白质相互作用发生美拉德反应，为食物提供独特的色泽与风味。

4、d-塔格糖作为一种天然存在的己酮糖，是d-果糖在c-4位的差向异构体，相对分子量为180.16，为白色结晶性粉末且易发生焦糖化反应和美拉德褐变反应，其甜度为蔗糖的92％，但能量仅为蔗糖的30％，属于低热量甜味剂。d-塔格糖能够满足巧克力、口香糖、蛋糕、冰激凌等大量含糖产品对低卡路里甜味剂的需求，也能与一些高强度甜味剂产生协同作用。2001年，d-塔格糖被fda批准为食品添加剂，并通过“一般公认安全(gras)”认证，世界卫生组织联合食品添加剂委员会在同年推荐d-塔格糖为一种新的低热量甜味剂，可以作为食品添加剂使用。2014年，中国批准d-塔格糖为新食品原料，可以用在除婴幼儿食品以外的食品中，并且对其摄入量没有限制。

5、稀少糖在自然界中含量较低，通常通过化学或生物法进行大量生产。化学法生产有一定的缺点，如反应条件剧烈不易控制、副产物较多不利于分离纯化等。相对来说生物法具有转化效率高、专一性强、副产物少，分离纯化简单等优点，因此成为稀少糖合成的主要方法。d-阿洛酮糖制备关键用酶是d-阿洛酮糖3-差向异构酶，可以d-果糖为原料经过差向异构化反应制备d-阿洛酮糖。shin等人以来源于石油热袍菌(thermotoga petrophila)的塔格糖酮酸3-差向异构酶(tagaturonate 3-epimerase)为研究材料，通过分子改造获得最优突变体s125d/n129t/l140p/t181a/h362l，其以d-果糖为底物制备d-塔格糖活性提高了184倍，该突变体被命名为塔格糖4-差向异构酶(tagatose 4-epimerase，t4e)(acscatalysis,2020,10(20):12212-12222)。但t4e仍存在热稳定性及比活力较差的问题，限制了工业应用。

6、在d-果糖与d-阿洛酮糖以及d-果糖与d-塔格糖的混合体系中，由于d-果糖和d-塔格糖/d-阿洛酮糖均为酮糖，常规的酮糖检测方法无法对二者进行区分，而现有通过d-果糖-脱氢酶检测d-果糖的方法而存在成本较高的缺陷，因此d-阿洛酮糖及d-塔格糖的检测手段匮乏。

技术实现思路

1、本发明公开了一种区分检测d-果糖与d-阿洛酮糖以及d-果糖与d-塔格糖的混合体系中特定糖的方法，并且利用所述方法筛选热稳定性及d-果糖转化率提高的塔格糖-4差向异构酶突变体。通过向稀少糖混合体系中加入干酵母溶液，代谢反应体系中的d-果糖，然后通过间苯二酚试剂对体系中剩余糖进行特异性检测。

2、本发明提供了一种检测d-果糖与稀少糖混合体系中的稀少糖的方法，先利用酵母消化d-果糖，再应用间苯二酚试剂对体系中剩余糖进行检测，所述稀少糖包括d-塔格糖和d-阿洛酮糖。

3、本发明还提供了所述方法在高通量筛选稀少糖制备关键酶中的应用。

4、本发明还提供了一种高通量筛选稀少糖制备关键酶的方法，包括以下步骤：

5、(1)向酶液中加入含d-果糖的缓冲液；

6、(2)向步骤(1)所得产物中加入酵母；

7、(3)用间苯二酚试剂对体系中剩余糖进行检测。

8、在一种实施方式中，所述关键酶包括d-阿洛酮糖3-差向异构酶、d-塔格糖3-差向异构酶或d-塔格糖4-差向异构酶。

9、在一种实施方式中，步骤(2)所述酵母为酿酒或毕赤酵母，浓度为0.1-50g·l-1。

10、在一种实施方式中，将步骤(2)所得产物于25-40℃、200-800r·min-1下反应12-36h。

11、在一种实施方式中，步骤(1)所述含d-果糖的缓冲液中包括5-500mmol·l-1d-果糖。

12、本发明还提供了所述方法筛选得到的d-塔格糖4-差向异构酶突变体，将seq idno.1所示的氨基酸序列进行以下任一突变：

13、(1)将第430位的异亮氨酸突变为脯氨酸；

14、(2)将第90位的甘氨酸突变为丝氨酸，将第272位的苏氨酸突变为丙氨酸，并将第430位的异亮氨酸突变为脯氨酸。

15、本发明还提供了表达所述突变体的宿主细胞。

16、本发明还提供了所述突变体，或所述宿主细胞在制备d-塔格糖或含d-塔格糖的产品方面的应用。

17、有益效果：

18、本发明提供了检测d-果糖与稀少糖混合体系中的稀少糖的方法，利用酵母对d-果糖进行消化处理，并用间苯二酚对剩余稀少糖进行检测，所述检测方法准确度高，成本低，单次检测单个样品的成本不超过0.1元。

19、本发明将上述方法应用于高通量筛选稀少糖制备关键酶，筛选出热稳定性和比活力提高的d-塔格糖4-差向异构酶突变体，与野生型相比，突变体i430p的热稳定性提高了1.83倍，g90s/t272a/i430p突变体比活力提高了21.4％。

技术特征：

1.一种检测d-果糖与稀少糖混合体系中的稀少糖的方法，其特征在于，先利用酵母消化d-果糖，再对体系中剩余糖进行检测；所述稀少糖包括d-塔格糖和d-阿洛酮糖。

2.利用权利要求1所述方法高通量筛选稀少糖制备关键酶的方法，其特征在于，所述关键酶能够利用d-果糖，所述方法包括以下步骤：

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述关键酶包括d-阿洛酮糖3-差向异构酶、d-塔格糖3-差向异构酶或d-塔格糖4-差向异构酶；当所述关键酶是d-阿洛酮糖3-差向异构酶或d-塔格糖3-差向异构酶时，所述剩余糖是d-阿洛酮糖；当所述关键酶是d-塔格糖4-差向异构酶时，所述剩余糖是d-塔格糖。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述酵母为酿酒酵母或毕赤酵母，终浓度为0.1-50g·l-1。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，将步骤(2)所得产物于25-40℃、200-800r·min-1下反应12-36h。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述含d-果糖的缓冲液中包括5-500mmol·l-1d-果糖。

7.权利要求1所述方法在高通量筛选稀少糖制备关键酶中的应用。

8.权利要求2～6任一所述方法筛选得到的d-塔格糖4-差向异构酶突变体，其特征在于，将seq id no.1所示的氨基酸序列进行以下任一突变：

9.表达权利要求8所述突变体的宿主细胞。

10.权利要求8所述突变体，或权利要求9所述宿主细胞在制备d-塔格糖或含d-塔格糖的产品方面的应用。

技术总结
本发明公开了一种D‑果糖及稀少糖的高通量检测方法，属于生物技术领域。本专利聚焦于D‑果糖到D‑阿洛酮糖或D‑塔格糖生物合成过程中产生的混合糖体系，通过活性干酵母特异性的代谢消耗D‑果糖，进而通过间苯二酚法测定反应体系中的D‑阿洛酮糖或D‑塔格糖。本专利的检测方法便捷高效，并且成本低。将上述方法应用于高通量筛选稀少糖制备关键酶，筛选出热稳定性和比活力提高的D‑塔格糖4‑差向异构酶突变体，与野生型相比，突变体I430P的热稳定性提高了1.83倍，G90S/T272A/I430P突变体比活力提高了21.4％。

技术研发人员：刘展志,吴敬,郭雪红
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14