一种石房蛤毒素的纳米抗体及其应用

本发明属于生物学及免疫学，具体地，涉及一种石房蛤毒素的纳米抗体及其应用。

背景技术：

1、石房蛤毒素(saxitoxin，stx)是由蓝藻和鞭毛藻产生的一种藻类毒素(海洋或淡水)。它是最具毒性的海洋生物毒素和麻痹性贝类毒素之一。人体主要通过食用受污染的贝类摄入这种致命毒素，可导致腹泻、呕吐、呼吸衰竭等麻痹性贝类毒素中毒症状，甚至会危及生命。这种毒素除了引起的明显的健康危害外，还会对环境和经济造成影响，如导致鱼类死亡、贝类污染，冲击商业渔业。我国食品药品监督管理局认为100g贝类肉中stx含量不宜超过80μg。目前，检测stx的方法主要有小鼠生物测定法、受体检测方法、高效液相色谱及其联用技术、细胞传感和化学传感等方法。小鼠生物测定法是检测stx的标准方法，尽管灵敏可靠，但因其需要使用到活体动物，因而时常受到伦理指责，近年来高效液相色谱方法正逐渐发展取代其成为标准方法。虽然这可以用于stx的官方控制测试。而值得注意的是，高效液相色谱法需使用昂贵的仪器和训练有素的人员来成功操作。因此，一种准确、快速、灵敏的检测方法开发对stx检测、控制及应用非常重要。

2、对于上述方法检测成本高、检测人员技术要求较高的问题。酶联免疫吸附测定方法(elisa)凭借其高灵敏度、低成本和高通量的优势被广泛用于食品，环境监测和医学等领域。然而目前大多数免疫技术通常依赖于单克隆抗体或者多克隆抗体，它们都不能耐受极端环境，例如高温、有机溶剂和强离子。且单克隆抗体在细胞融合时失败率较高，前期的筛选过程冗长且复杂，而多克隆抗体普遍存在特异性差的弊端，这极大地限制了其在分析和研究中的广泛应用。

3、纳米抗体又称单域重链抗体(vhh)是由骆驼类中独特的重链抗体衍生的小抗原结合片段。与传统抗体相比，纳米抗体具有体积小(12-15kda，约为传统抗体的十分之一)、结构域单一、亲和性强、稳定性高(耐高温和极端ph条件)、深入组织渗透、缺乏糖基化和fc介导的免疫激活、原核生产量大、成本低等特点。尽管它们的尺寸很小，但纳米抗体能够以高亲和力和选择性结合抗原。它们的结合主要由三个高变量环决定，称为互补决定区域或cdr区。迄今为止，针对不同的分子靶标已经产生了广泛的纳米体，应用范围涵盖基础研究、诊断和治疗。然而，目前针对stx的纳米抗体尚未见报道，因此针对stx高亲和力、高特异性、高稳定性的纳米抗体的开发，有望填补石房蛤毒素纳米抗体在免疫学中的空白，并有利于扩宽实际场景中stx免疫检测应用，降低石房蛤毒素对环境和经济造成的影响。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术的不足，提供一种石房蛤毒素纳米抗体及其应用，填补目前尚无石房蛤毒素纳米抗体的空白，解决现有技术中的抗体对石房蛤毒素特异的识别和结合能力弱、不易于表达和表达效率低的问题。

2、本发明的第一目的是提供一种石房蛤毒素的纳米抗体。

3、本发明的第二目的是提供一种石房蛤毒素的纳米抗体的编码基因。

4、本发明的第三目的是提供一种重组载体。

5、本发明的第四目的是提供一种重组细胞。

6、本发明的第五目的是提供所述纳米抗体、所述编码基因、所述重组载体、和/或所述重组细胞中的一种或几种在制备石房蛤毒素的免疫学检测试剂盒中的应用。。

7、本发明的第六目的是提供一种非诊断目的检测的方法。

8、本发明的第七目的是提供一种石房蛤毒素的免疫学检测试剂盒。

9、本发明上述目的通过以下技术方案实现：

10、本发明通过购买自深圳康体生命科技有限公司的纳米抗体天然文库kt-006，采用噬菌体展示技术，将检测抗原固相包被于酶标板上，投入纳米抗体天然文库kt-006进行亲和淘筛，获得一种抗石房蛤毒素特异性结合的纳米抗体，其氨基酸序列如seq id no.1所示，其具有亲和力高，特异性强、稳定性好的优点。并应用于石房蛤毒素的免疫学检测分析，通过此免疫检验分析建立了一种快速、灵敏并且稳定的石房蛤毒素的检测方法，同时评估了抗石房蛤毒素的纳米抗体在检测应用中的稳定性。

11、本发明要求保护一种石房蛤毒素的纳米抗体，所述纳米抗体包括框架区fr和互补决定区cdr，所述框架区fr为：氨基酸序列如seq id no：2所示的fr1，氨基酸序列如seq idno：3所示的fr2，氨基酸序列如seq id no：4所示的fr3和氨基酸序列如seq id no：5所示的fr4；所述互补决定区cdr为：氨基酸序列为grnfngla所示的cdr1，氨基酸序列为irygiphy的cdr2和seq id no：6所示的cdr3。

12、具体地：

13、抗石房蛤毒素的纳米抗体框架区fr1的氨基酸如seq id no.2所示：

14、avqlvesggglvqaggsmrlscets；

15、抗石房蛤毒素的纳米抗体框架区fr2的氨基酸如seq id no.3所示：

16、wfrqapgkerelvaa；

17、抗石房蛤毒素的纳米抗体框架区fr3的氨基酸如seq id no.4所示：

18、adsvkgrftisrdngkatidlqmnnlkpddtavyyc；

19、抗石房蛤毒素的纳米抗体框架区fr4的氨基酸如seq id no.5所示：

20、wgpgtqvtvs；

21、抗石房蛤毒素的纳米抗体互补决定区cdr3的氨基酸如seq id no.6所示：

22、ttsdtgwnvqtyty。

23、优选地，所述纳米抗体的氨基酸序列如seq id no：1所示。

24、具体地，seq id no.1：

25、avqlvesggglvqaggsmrlscetsgrnfnglawfrqapgkerelvaairygiphyadsv kgrftisrdngkatidlqmnnlkpddtavyycttsdtgwnvqtytywgpgtqvtvs。

26、本发明还要求保护一种石房蛤毒素的纳米抗体的编码基因，所述编码基因编码所述纳米抗体。

27、优选地，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no：7所示。

28、具体地，seq id no.7：

29、gcggtgcagctggtggagtctgggggaggattggtgcaggctgggggctctatgcgac

30、tctcctgtgaaacctctggacgcaacttcaatggattggcctggttccgccaggctcca

31、gggaaggagcgtgaacttgttgctgctattaggtatggtattccgcactatgccgactc

32、cgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacggcaaggccacaattgatctgcaa

33、atgaacaacctgaaacctgacgacacggccgtttattactgtgtcgtctcggatacgggttggaatgtccagacatacacttactggggcccggggacccaggtcaccgtctcc。

34、本发明还保护一种重组载体，所述重组载体连接有所述编码基因。

35、本发明还保护一种重组细胞，所述重组细胞含有所述表达载体、或能够表达所述纳米抗体。

36、本发明还保护所述纳米抗体、所述编码基因、所述重组载体、和/或所述重组细胞中的一种或几种在制备石房蛤毒素的免疫学检测试剂盒中的应用。

37、本发明进一步保护一种非诊断目的检测的方法，利用所述纳米抗体。

38、优选地，基于间接elisa(icelisa)方法进行检测，以石房蛤毒素半抗原与载体蛋白偶联得到的石房蛤毒素完全抗原作为作为检测抗原，用所述纳米抗体作为检测抗体进行检测，所述石房蛤毒素半抗原为膝沟藻毒素-1&-4。

39、更优选地，所述载体蛋白为牛血清蛋白(bovine serμm albμmin，bsa)。

40、进一步优选地，包被有检测抗原的固相载体中加入待测样品以及所述纳米抗体，充分反应后弃去液体并洗涤；加入酶标记抗二体充分反应后弃去液体并洗涤，充分反应后弃去液体并洗涤；进行显色反应，终止反应；读450nm od值。

41、更进一步优选地，显色a液与显色b液混合的tmb显色液进行显色反应，10％h2so4(v/v)终止反应。

42、一种石房蛤毒素的免疫学检测试剂盒，含有所述纳米抗体。

43、优选地，还含有包被有石房蛤毒素半抗原与载体蛋白偶联得到的石房蛤毒素完全抗原，所述石房蛤毒素半抗原为膝沟藻毒素-1&-4。

44、更优选地，所述固相载体为酶标版。

45、更优选地，还包括酶标二抗、显色剂和终止剂。

46、再更优选地，显色剂为显色液a与显色液b。

47、再更优选地，终止剂为10％ h2so4(v/v)。

48、再更优选地，酶标二抗为anti-vhh-hrp二抗。

49、本发明具有以下有益效果：

50、本发明得到了一个特异性识别石房蛤毒素的纳米抗体，具有独特的可变区序列，其能够特异性识别和结合石房蛤毒素，并且其具有易于表达和表达效率高的优点，使得其可以应用于检测石房蛤毒素的酶联免疫分析方法中，该方法ic50为6.56ng/ml，线性范围为0.09-180ng/ml，该方法的检测结果准确、效果好，对石房蛤毒素类似物的交叉反应良好。本发明提供的抗石房蛤毒素的纳米抗体，具有制造简易、表达率高、特异性强、稳定性好和免疫原性低等优点，这填补了石房蛤毒素纳米抗体在免疫学中的空白，并有利于扩宽石房蛤毒素实际场景中免疫检测应用。