用于抗草甘膦除草剂基因的叶绿体转运肽及其应用

本发明属于植物生物，具体涉及一种用于抗草甘膦除草剂基因的叶绿体转运肽；还涉及含有该叶绿体转运肽的融合基因和融合蛋白，以及它们的用途。

背景技术：

1、草甘膦是美国孟山都公司生产的除草剂农达(roundup)的主要活性成分，具有高效、广谱、低毒、易于被微生物分解等优点。草甘膦作为一种内吸传导型除草剂，喷洒于植物茎叶后，即可被植物吸收，并可迅速传导到整个植株及其根部，从而消灭杂草。然而草甘膦作为一种非选择性除草剂，在杀灭杂草的同时，对农作物同样具有灭生性，因而其使用范围和使用时间受到很大限制。

2、5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(epsps)是植物体内莽草酸途径的关键酶，同时是草甘膦的作用靶点，通过导入对草甘膦不敏感的epsps基因或在转基因植物中过表达epsps基因可以有效地提高植株的草甘膦耐受性。随着抗草甘膦epsps基因的不断发现，通过转基因技术将抗草甘膦epsps基因转化到作物中从而获得抗草甘膦除草剂的作物，已成为解决草甘膦除草剂非选择性问题的有效手段。目前已经应用于棉花中的抗草甘膦除草剂基因主要有美国孟山都公司的cp4-epsps基因和中国农业科学院生物技术研究所的gr79-epsps基因(zl2014102047036)。

3、epsps在植物细胞中定位于叶绿体，因此，除了epsps抗除草剂基因本身之外，还需要具有高效率靶向作用的叶绿体转运肽(chloroplast transpit peptide，简称ctp，亦称叶绿体导肽或前导肽等)，进一步将epsps酶转运至叶绿体内发挥作用。故叶绿体转运肽对epsps在叶绿体中能否有效发挥作用至关重要。

4、目前商业化的抗草甘膦除草剂转基因棉花(美国孟山都公司)主要是利用来源于拟南芥epsps基因的叶绿体转运肽atctp和来源于农杆菌的cp4epsps基因融合并将其导入棉花获得。由于该叶绿体转运肽atctp来源于拟南芥，属于异源基因，在棉花中表达后转运功能低于自身内部叶绿体转运肽的转运效率。因此，如果利用棉花自身的叶绿体转运肽和抗除草剂基因融合并导入棉花，可以大大提高将抗草甘膦除草剂epsps蛋白转运至棉花叶绿体中的效率，从而提高转基因棉花对草甘膦除草剂的抗性。

5、目前，尚未发现有关用于转运抗草甘膦除草剂蛋白的棉花叶绿体转运肽的报道。

技术实现思路

1、本发明目的在于提供一种叶绿体转运肽。

2、本发明另一目的在于提供编码上述叶绿体转运肽的基因。

3、本发明第三目的在于提供含有上述叶绿体转运肽基因的融合基因。

4、本发明第四目的在于提供上述融合基因编码的融合蛋白。

5、为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

6、一种叶绿体转运肽，所述叶绿体转运肽的氨基酸序列如seq id no.1所示。

7、本发明还提供编码上述叶绿体转运肽的基因，命名为：ghctp1，所述基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。

8、本发明还提供了上述叶绿体转运肽或基因在转运抗草甘膦除草剂蛋白上的应用。

9、上述应用中所述的抗草甘膦除草剂蛋白是指cp4 epsps蛋白或gr79epsps蛋白等。

10、本发明还提供了上述叶绿体转运肽或基因在培育抗草甘膦除草剂植物上的应用。

11、所述的植物是指棉花、油菜或大豆等。

12、所述的棉花是指陆地棉(gossypium hirsutum linn.)或海岛棉(gossypiumbarbadense linn.),如r15、wc、su12等棉花品系。

13、本发明还提供了含有上述基因的表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组细菌等。

14、本发明还提供了上述表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组细菌等在培育抗草甘膦除草剂植物上的应用。

15、所述的植物是指棉花、油菜或大豆等。

16、所述的棉花是指陆地棉(gossypium hirsutum linn.)或海岛棉(gossypiumbarbadense linn.),如r15、wc、su12等棉花品系。

17、本发明还提供一种融合基因，所述的融合基因由上述叶绿体转运肽基因和抗草甘膦除草剂基因组成；所述叶绿体转运肽基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。

18、上述融合基因中所述的抗草甘膦除草剂基因是指gr79 epsps基因或cp4 epsps基因等。

19、所述的gr79 epsps基因的核苷酸序列如seq id no.5所示。

20、所述的融合基因的核苷酸序列如seq id no.6所示。

21、本发明还提供了上述融合基因编码的融合蛋白，所述的融合蛋白由上述叶绿体转运肽和抗草甘膦除草剂蛋白组成。

22、上述融合蛋白中所述的叶绿体转运肽的氨基酸序列如seq id no.1所示。

23、上述融合蛋白中所述的抗草甘膦除草剂蛋白是指gr79 epsps蛋白或cp4 epsps蛋白等。

24、所述gr79 epsps蛋白的氨基酸序列如seq id no.7所示。

25、所述融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.8所示。

26、上述融合基因或融合蛋白在培育抗草甘膦除草剂植物上的应用。

27、所述的植物是指棉花、油菜或大豆等。

28、所述的棉花是指陆地棉(gossypium hirsutum linn.)和海岛棉(gossypiumbarbadense linn.),如r15、wc、su12等棉花品系。

29、本发明还提供含有上述融合基因的表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组细菌等。

30、所述的表达盒由包括camv 35s启动子、nos终止子和上述融合基因。

31、所述的表达载体是指将上述表达盒连接于pbi121载体上即可获得抗除草剂植物表达载体pbi121-ghctp1-gr79 epsps。

32、上述表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组细菌等在培育抗草甘膦除草剂植物上的应用。

33、所述的植物是指棉花、油菜或大豆等。

34、所述的棉花是指陆地棉(gossypium hirsutum linn.)和海岛棉(gossypiumbarbadense linn.)；如r15、wc或su12等棉花品系。

35、本发明还提供了一种培育耐草甘膦除草剂棉花品种的培育方法，通过转基因方法将上述含有叶绿体转运肽和gr79 epsps的融合基因导入棉花，然后筛选对草甘膦除草剂具有耐性的后代。

36、本发明还提供了一种提高棉花耐草甘膦除草剂能力的方法，包括通过转基因方法将含有叶绿体转运肽和gr79 epsps融合基因的植物表达载体导入棉花，筛选耐草甘膦除草剂的转基因后代材料。

37、上述方法所述的植物表达载体中叶绿体转运肽的核苷酸序列如seq id no.2所示。

38、本发明还提供一种利用上述叶绿体转运肽培育抗草甘膦除草剂的棉花品种的方法，包括如下步骤：

39、(1)叶绿体转运肽序列人工合成：根据seq id no.2所示人工合成ghctp1基因的核苷酸序列；然后在seq id no.2所示序列的5’端和3’端分别添加bamhi酶切位点和pst i酶切位点，分别获得seq id no.3所示的正义链和seq id no.4所示的反义链；将seq id no.3所示的正义链和seq id no.4所示的反义链在水浴锅中退火形成获得含有粘性末端的叶绿体转运肽双链dna片段；

40、(2)植物表达载体构建：利用bamh i和pst i双酶切pbi121植物表达载体；通过t4dna连接酶将步骤(1)中的叶绿体转运肽双链dna片段(ghctp1序列)插入至pbi121植物表达载体的camv 35s启动子和t-nos终止子之间，获得pbi121-ghctp1载体；然后利用pst i和xho i双酶切将gr79 epsps基因插入至pbi121-ghctp1载体中的ghctp1和t-nos终止子之间，获得抗草甘膦除草剂的植物表达载体，命名为：pbi121-ghctp1-gr79 epsps；

41、(3)转基因抗除草剂棉花创制：将步骤(2)所得的植物表达载体导入农杆菌，然后利用农杆菌介导的棉花遗传转化方法将植物表达载体导入棉花，获得含有ghctp1和gr79epsps融合基因的转基因棉花；

42、(4)对步骤(3)中所得的转基因植株进行分子鉴定和草甘膦除草剂抗性鉴定，选择耐草甘膦除草剂的棉花植株。

43、本发明还提供了一种耐除草剂棉花品种的育种方法，包括以上述方法获得的耐草甘膦除草剂转基因棉花为亲本之一，通过杂交或者回交的方法，在后代中选择耐除草剂能力强的植株，连续选择4～5代或回交4～5代即可获得耐草甘膦除草剂棉花品种。

44、与现有技术相比，本发明具有的优点和有益技术效果：本发明叶绿体转运肽ghctp1转运效率高，并且可以与任何一种除草剂epsps基因融合表达，增强棉花等植物对草甘膦除草剂的耐受性。本发明对棉花等植物生产过程中降低杂草危害、减少人工除草投入、降低生产成本和提高产量具有重要意义。