一种生物结合化学法制备D-脯氨酸的方法与流程

本发明属于生物技术和化工领域，涉及一种生物结合化学法制备d-脯氨酸的方法，更具体的是一种基因工程重组菌株e.coli bl21/petduet-race-dglucy的构建，以及利用其催化产物结合化学合成d-脯氨酸的方法。

背景技术：

1、d-脯氨酸(d-proline，分子式：c5h9no2，cas号：344-2532)是一类重要的手性试剂和手性中间体。既可用作拆分试剂和手性试剂，也可以作为合成某些手性药物的手性中间体，如可以作为抗偏头痛药物依来曲普坦的关键手性中间体。依来曲普坦(eletriptan)是由辉瑞公司开发的于2001年首次在澳大利亚上市，后续在多个国家上市，市场需求量较大，其作用原理主要是通过激活人体内5-ht1相关受体抑制神经肽释放，收缩颅内血管丙抑制神经性炎症发挥抗偏头痛效应；此外，d-脯氨酸还是合成一叶萩型生物碱(-)-securininea的关键前体，该生物碱用于临床治疗小儿麻痹症、肌萎缩侧索硬化症和慢性再生障碍性贫血等疾病；并且，d-脯氨酸还是合成(r)-harmicine的关键前体，该物质是一种具有多重药理活性的β-咔啉生物碱。而作为不对称的有机催化剂是由于d-脯氨酸具有刚性构象，可以作为不对称有机催化剂催化多个反应如不对称mannich反应、aldol反应、mannich–azamichael反应、morita-bayllis-hillman反应、heck交叉偶联反应、多组分反应，用于合成各种结构的手性分子。综上，d-脯氨酸无论是作为手性试剂还是作为医药中间体都具有重要的价值，具有广阔的市场前景。

2、目前，d-脯氨酸的制备方法可以分为化学法和生物法两种。化学法目前工业上主要是通过采用化学不对称转化技术制备，该技术是以l-脯氨酸为原料，正丁醛为催化剂，在正丁酸溶剂中与l-酒石酸反应制备d-脯氨酸-l-酒石酸盐，然后在甲醇中用氨水处理得到d-脯氨酸，该方法主要存在生产成本偏高、环境污染大等问题；另一种化学方法制备d-脯氨酸是以吡咯烷-2-甲醛为原料，不对称还原为d-脯氨醇，然后氧化为d-脯氨酸，但是该方法需要采用昂贵的原料和手性金属催化剂，d-脯氨酸的对映体过量(enantiomeric excess，ee)值也不高。

3、生物法制d-脯氨酸的方法主要有生物不对称合成法制备、生物拆分法制备、对映选择性降解法制备d-脯氨酸。其中，生物不对称合成法主要是以l-精氨酸为原料，化学合成l-cl-精氨酸，利用微生物菌体将其水解为(s)-5-氨基-2-氯戊酸，然后自动反转、关环为d-脯氨酸，该路线成本非常高，不适合工业化应用；生物拆分法主要是利用一种特异性的酶去作用于dl-脯氨酸衍生物中的l-脯氨酸衍生物，而d-脯氨酸衍生物得到保留。l-脯氨酸衍生物被酶催化后还原为l-脯氨酸，分离出的l-脯氨酸可作为制备dl-脯氨酸的原料；对映体选择降解法制备主要是以dl-脯氨酸为原料，通过特定微生物在培养基中生长的同时降解dl-脯氨酸中的l-脯氨酸，d-脯氨酸得到保留。该法的优点是环境污染较轻，但是制备的产量较低，依赖于底物dl-脯氨酸原材料，所制备d-脯氨酸的成本高，无法工业化应用。

4、由于生物法制备d-脯氨酸的技术和成本问题，市场上现有技术为化学法生产，因此，针对于现有化学法、生物法制备d-脯氨酸的关键问题，开发更为高效、低成本的d-脯氨酸合成工艺技术具有重要的价值和意义。

技术实现思路

0、
技术实现要素：

1、本发明提供了一种生物酶法催化+化学法合成d-脯氨酸的路线，相比单一的化学法和生物催化方法，选用了更为廉价易得的底物l-谷氨酸作为前体物质，不受原材料来源限制，酶法催化步骤反应完全，得率更高，化学法反应完全，产物手性纯度更高，为一条全新的d-脯氨酸合成路线。

2、为实现此目的，本发明采用的技术方案如下：

3、一种生物结合化学法制备d-脯氨酸的方法，包括以下步骤：

4、1)含有谷氨酸消旋酶基因和d-谷氨酸环化酶基因共表达载体的基因工程菌作为催化剂，用l-谷氨酸为前体，催化合成d-脯氨酸前体5-氧代-d-脯氨酸；

5、2)以5-氧代-d-脯氨酸化学法合成d-脯氨酸。

6、所述的方法，

7、谷氨酸消旋酶基因和d-谷氨酸环化酶基因构建至表达载体；将共表达载体转化至表达菌株中，抗生素筛选后即为含有谷氨酸消旋酶和d谷氨氨酸环化酶基因的工程重组菌株。

8、进一步地，

9、谷氨酸消旋酶基因和d-谷氨酸环化酶基因构建至大肠杆菌原核表达载体petduet-1，其中谷氨酸消旋酶基因构建至petduet-1中的多克隆位点mcs1中，基因5’端带有ncoi酶切位点，基因3’端带有hindiii酶切位点；d-谷氨酸环化酶基因构建至petduet-1的多克隆位点mcs2中，基因5’端带有ndei酶切位点，基因3’端带有xhoi酶切位点；将共表达质粒构建至大肠杆菌表达菌株bl21(de3)中，抗生素筛选后即为含有谷氨酸消旋酶和d谷氨氨酸环化酶基因的工程重组菌株e.coli bl21/petduet-race-dglucy。

10、更进一步地，谷氨酸消旋酶基因race的氨基酸序列如seq id no.1所示；d-谷氨酸环化酶基因dglucy的氨基酸序列如seq id no.2所示。

11、所述的方法，

12、工程菌发酵过程为：从lb的固体培养基上挑取单菌落接种于lb液体培养基中，180-220rpm，30-37℃振荡过夜培养，次日按照0.5-2％接种量接种至tb发酵培养基中，180-220rpm，30-37℃振荡培养4-6h，待od600nm＝0.4-0.6时，添加终浓度为0.5-1％的乳糖，180-220rpm，25-30℃诱导培养8-12h，收集菌体，进行后续的全细胞的催化合成反应。

13、所述的方法，催化合成d-脯氨酸前体5-氧代-d-脯氨酸的过程：

14、l-谷氨酸用适量缓冲液溶解后，加入磷酸吡哆醛、mncl2，再加入适量水搅拌溶解后，调ph，加入基因工程重组菌株反应。

15、进一步地，

16、催化合成体系中l-谷氨酸的浓度为3.5-50g/l，反应ph为7.0-8.0，反应温度为30-35℃，180-220r/min，磷酸吡哆醛含量为20-50.0mg/l，mncl2含量为20-50mg/l，湿菌体浓度为200-400g/l；反应时间3-7h。

17、所述的方法，5-氧代-d-脯氨酸经过酯化、酰氯化、水解反应三个步骤最后得到d-脯氨酸。

18、进一步包括：

19、将步骤1)反应液超滤除去酶液后，加入甲醇溶液进行酯化反应，在搅拌下缓慢滴加98％硫酸，保持温度65-70℃反应，至反应液全部变清，低温冷却至5-10℃，调节ph＝7.5-8.0，收集沉淀；将沉淀溶解后用光气进行酰氯化反应，待反应完成后，向体系中加入盐酸溶液，后用醇溶结晶后，得到目的产物d-脯氨酸。

20、本发明还提供了工程重组菌株，谷氨酸消旋酶基因和d-谷氨酸环化酶基因构建至表达载体；将共表达载体转化至表达菌株中，抗生素筛选后即为含有谷氨酸消旋酶和d谷氨氨酸环化酶基因的工程重组菌株；

21、进一步地：

22、谷氨酸消旋酶基因和d-谷氨酸环化酶基因构建至大肠杆菌原核表达载体petduet-1，其中谷氨酸消旋酶基因构建至petduet-1中的多克隆位点mcs1中，基因5’端带有ncoi酶切位点，基因3’端带有hindiii酶切位点；d-谷氨酸环化酶基因构建至petduet-1的多克隆位点mcs2中，基因5’端带有ndei酶切位点，基因3’端带有xhoi酶切位点；将共表达质粒构建至大肠杆菌表达菌株bl21(de3)中，抗生素筛选后即为含有谷氨酸消旋酶和d谷氨氨酸环化酶基因的工程重组菌株e.coli bl21/petduet-race-dglucy；

23、更进一步地，谷氨酸消旋酶基因race的氨基酸序列如seq id no.1所示；d-谷氨酸环化酶基因dglucy的氨基酸序列如seq id no.2所示。

24、本发明还提供了所述的工程重组菌株在制备d-脯氨酸中的应用。

25、本发明提供了所述的重组菌株用于d-脯氨酸前体5-氧代-d-脯氨酸的催化制备，其中谷氨酸消旋酶race是以l-谷氨酸为底物催化合成d-谷氨酸，d-谷氨酸环化酶dglucy是以d-谷氨酸为底物催化合成5-氧代-d-脯氨酸。

26、本发明采用酶法+化学法相结合的方法生产脯氨酸，摒弃了化学法不对称转化技术的缺点，利用了酶法高效合成的优点，且选择大宗原材料谷氨酸为起始底物，原料的来源简单易获得，不受原材料来源限制，在谷氨酸消旋酶和d-谷氨酸环化酶的作用生成5-氧代-d-脯氨酸，再结合化学方法生成d-脯氨酸，该技术相比现有的化学合成法和生物法技术具有明显优势：原材料易获得、成本更低、谷氨酸的消旋反应结合环化反应，反应向正向发生，转化效率更高，产物手性纯度更高，为一条全新的d-脯氨酸合成路线。