来源于橡胶树的硫氧还蛋白HbTRXy2及其相关生物材料与应用

本发明涉及生物，具体涉及来源于橡胶树的硫氧还蛋白及其相关生物材料与应用。

背景技术：

1、天然橡胶是重要的工业原料和不可或缺的战略物资。橡胶树(heveabrasiliensis muell.arg.)是天然橡胶的主要来源。我国是世界最大的天然橡胶消费国，年消费量约550万吨，但我国的年产量仅80万吨，自给率不足15％。我国主要在云南省、海南省和广东省的一些地区种植橡胶树，这些地区属于非传统植胶区，橡胶树生长过程中经常遭受低温、干旱以及台风等非生物逆境胁迫。此外，我国胶园橡胶树死皮(或称割面干涸，tapping panel dryness；主要症状表现为割胶后割线局部或全部不排胶)的发生也比较严重。目前，我国胶园的死皮率普遍在30％以上，导致严重的产量和经济损失。无论非生物胁迫还是死皮都伴随着氧化胁迫的发生，调节和维持细胞氧化还原平衡对于橡胶树抵御非生物胁迫以及降低死皮发生具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是如何提高生物对氧化胁迫以及其他非生物胁迫的抗性和/或确定橡胶树硫氧还蛋白hbtrxy2的功能及应用。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

2、为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

3、本发明的目的是提供一种蛋白质、调控所述蛋白质的编码基因表达的物质或调控所述蛋白质含量的物质的应用，所述应用为下述任一种：

4、d1)在调控生物氧化胁迫抗性中的应用；

5、d2)在制备调控生物氧化胁迫抗性的产品中的应用；

6、d3)在选育抗氧化能力提高的生物品种中的应用；

7、d4)在调控生物的非生物胁迫抗性中的应用；

8、d5)在制备调控生物的非生物胁迫抗性的产品中的应用；

9、d6)在选育非生物胁迫抗性提高的生物品种中的应用；

10、上述蛋白质名称为hbtrxy2，来源于大戟科橡胶树属橡胶树(hevea brasiliensismuell.arg.)，为下述任一种：

11、a1)氨基酸序列是seq id no.1的蛋白质，由168个氨基酸组成；

12、a2)将seq id no.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

13、a3)在a1)或a2)的n端和/或c端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。

14、本文所述标签蛋白包括但不限于poly-arg标签蛋白，该标签蛋白含5-6氨基酸残基(通常为5个，序列为rrrrr)，或poly-his标签蛋白，该标签蛋白含2-10氨基酸残基(通常为6个，序列为hhhhhh)，或flag标签蛋白，该标签蛋白含8个氨基酸残基(序列为dykddddk)，或strep-tag ii标签蛋白，该标签蛋白含8个氨基酸残基(序列为wshpqfek)，或c-myc标签蛋白，该标签蛋白含8个氨基酸残基(序列为wshpqfek)。

15、上述a2)中的hbtrxy2可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述a2)中的hbtrxy2的编码基因可通过将序列表中seq id no.2所示的dna序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上前述标签的编码序列得到。

16、为解决上述技术问题，本发明还提供了与上述hbtrxy2蛋白相关的生物材料在下述任一种中的应用，

17、d1)在调控生物氧化胁迫抗性中的应用；

18、d2)在制备调控生物氧化胁迫抗性的产品中的应用；

19、d3)在选育抗氧化能力提高的生物品种中的应用；

20、d4)在调控生物的非生物胁迫抗性中的应用；

21、d5)在制备调控生物的非生物胁迫抗性的产品中的应用；

22、d6)在选育非生物胁迫抗性提高的生物品种中的应用；

23、所述生物材料为下述b1)至b7)中的任一种：

24、b1)编码前述蛋白质的核酸分子；

25、b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；

26、b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b2)所述表达盒的重组载体；

27、b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物；

28、b5)含有b1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有b2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

29、b6)含有b1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有b2)所述表达盒的转基因植物组织；

30、b7)含有b1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有b2)所述表达盒的转基因植物器官。

31、上述生物材料中，b1)所述核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)或b4)的基因：

32、b1)核苷酸序列是序列表中seq id no.2的第179-685位的cdna分子或dna分子；

33、b2)核苷酸序列是序列表中seq id no.2的cdna分子或dna分子；

34、b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有90％以上同一性，且编码hbtrxy2的cdna分子或基因组dna分子；

35、b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码hbtrxy2的cdna分子或基因组dna分子。

36、其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。

37、其中，seq id no.2由852个核苷酸组成，第179-685位为编码区，编码seq id no.1所示的hbtrxy2。

38、本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码hbtrxy2的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的编码hbtrxy2的核苷酸序列90％或者更高同一性的核苷酸，只要编码hbtrxy2且具有hbtrxy2功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

39、这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码hbtrxy2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

40、上述严格条件是在2×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×sspe(或0.1×ssc)、0.1％sds的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

41、上述90％以上同一性，可为90％或95％以上的同一性。

42、上述生物材料中，b2)所述的含有编码hbtrxy2的核酸分子的表达盒(hbtrxy2基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达hbtrxy2的dna，该dna不但可包括启动hbtrxy2基因转录的启动子，还可包括终止hbtrxy2基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35s；来自番茄的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(pr1)(由水杨酸和bth(苯并噻二唑-7-硫代羟酸s-甲酯)诱导)；番茄蛋白酶抑制剂ii启动子(pin2)或lap启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子；四环素诱导型启动子；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pf128，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子)。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(nos终止子)、花椰菜花叶病毒camv 35s终止子、tml终止子、豌豆rbcs e9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子。

43、可用现有的表达载体构建含有所述hbtrxy2基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pahc25、pbin438、pcambia1302、pcambia2301、pcambia1301、pcambia1300、pbi121、pcambia1391-xa或pcambia1391-xb(cambia公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mrna加工或基因表达的dna片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mrna前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(gus基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptii基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的epsps基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

44、上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒可为酵母表达载体pyes2。

45、上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如大肠杆菌。所述酵母可为酿酒酵母菌株invscl。

46、上述生物材料中，所述转基因植物细胞系不包括繁殖材料。

47、本文所述生物可为微生物，如酵母。

48、在本发明的一个实施方式中，hbtrxy2的编码基因通过含有hbtrxy2基因表达盒的重组载体导入酿酒酵母菌株invscl中得到重组微生物。所述重组载体为将酵母表达载体pyes2的kpn i和xba i识别位点间的序列替换为序列表中seq id no.2的第179-685位核苷酸所示的dna分子，得到的重组载体。所述重组载体表达seq idno.1所示的hbtrxy2。所述重组微生物表达序列1所示的hbtrxy2。

49、上述应用中，所述氧化胁迫可为过氧化氢诱导的氧化胁迫。所述非生物胁迫可为低温、干旱和盐胁迫中的一种。

50、本发明的另一个目的是提供一种培育氧化胁迫抗性提高转基因生物的方法，所述方法包括提高目的生物中前述蛋白质的编码基因的表达量，得到氧化胁迫抗性高于所述目的生物的抗氧化胁迫生物。

51、进一步地，所述提高目的生物中所述蛋白质的编码基因的表达量通过前述蛋白质的编码基因导入所述目的生物中实现。

52、上述方法中，b1)所述核酸分子可先进行如下修饰，再导入所述受体生物中，以达到更好的表达效果：

53、1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述hbtrxy2编码基因的核苷酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的gc含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中gc含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；

54、2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

55、3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

56、4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于camv的tml，来源于rbcs的e9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

57、5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于tmv，mcmv和amv)。

58、上述方法中，所述hbtrxy2编码基因可为b1)所述核酸分子。

59、上述方法中，所述受体生物可为微生物或植物。所述目的生物具体可为酵母，所述植物具体可为橡胶树。

60、上述方法中，所述氧化胁迫可为过氧化氢诱导的氧化胁迫。

61、前文中所述的蛋白质和生物材料也属于本发明的保护内容。

62、实验证明，本发明的hbtrxy2基因在橡胶树各组织中均有表达，其中在变色期叶、淡绿期叶和胶乳中的表达量较高。hbtrxy2基因的表达受氧化、低温、干旱和盐胁迫的诱导。利用酵母表达系统对hbtrxy2基因的功能鉴定表明，酵母中超量表达hbtrxy2基因会提高重组酵母对过氧化氢诱导的氧化胁迫的抗性。可通过将hbtrxy2基因在植物或微生物中超量表达的方法提高其对氧化胁迫的抗性。