具有生物活性的波形蛋白及应用

本申请涉及活性蛋白制备，具体涉及具有生物活性的波形蛋白及应用。

背景技术：

1、波形蛋白(vimentin，vim)为高度保守的真核细胞骨架ⅲ型中间丝蛋白，主要表达于中胚层起源的间充质细胞中，以多聚体纤维稳定存在。vim仅溶于离子型表面活性剂如尿素、盐酸胍等溶液。vim具有调节细胞迁移、粘附、信号传导、自身抗原和细胞因子特性，诱导t细胞增殖并介导体内免疫反应，在感染、肿瘤、自身免疫、固有免疫等方面显现多种功能，具有生物药品开发的广阔前景。

2、等电点法是一种常用于提取波形蛋白的方法，等电点法利用蛋白质在等电点时溶解度最低而各种蛋白质又具有不同等电点的特点进行分离的方法。等电点法提取的波形蛋白的过程，也是蛋白质多步骤变性的过程，首先是带负电荷的硫酸盐基团与带相反电荷的碱性氨基酸侧链相互作用。如采用十二烷基磺酸钠(sds)分子时，其疏水尾部埋在蛋白质的疏水核心中，开始破坏蛋白质的固有结构。最后，多肽链的很大一部分，独立于其在原生状态下的构象，采用α-螺旋构象，并被sds分子胶束包围。

3、因此，通过常用等电点法提取的波形蛋白，制备的波形蛋白存在纯度低，蛋白活性弱等技术问题。

技术实现思路

1、等电点法提取的波形蛋白粉末经过超滤透析除去绝大多数盐等物质后，但仍然会存在sds分子，因此等电点法所提取的波形蛋白构像丧失了其天然构像，即特征性的折叠三维结构，使其不能像在天然条件下那样发挥功能。因此，可以采取将波形蛋白和如sds分子的表面活性剂形成的复合物分离并去除表面活性剂从而实现蛋白质生物结构的恢复，从而解决和缓解现有存在的技术问题。

2、为达到以上目的，本申请提供了如下技术方案：

3、(1)一种具有生物活性的波形蛋白，所述波形蛋白的分子量为53.6kd，所述波形蛋白通过提取和复性的步骤获得；其中，所述提取的步骤包括：

4、a.将新鲜猪脑剪碎；

5、b.加入第一盐溶液混合成匀浆溶液，将匀浆溶液中加入聚乙二醇单辛基苯基醚，搅拌，离心，弃上清液，留沉淀物；所述第一盐溶液为100mmol/l kcl、2mmol/lmgcl2、2mmol/l edta、20mmol/l k3po4和0.5mmol/l pmsf，ph为6.8的混合溶液；

6、c.重复b步骤三次，将沉淀物加入第一盐溶液混合成匀浆溶液，搅拌，离心，获得第一沉淀；

7、d.将所述第一沉淀重悬于第二盐溶液，搅拌，离心，获得第二沉淀；所述第二盐溶液为500mol/l nacl、5mmol/l edta、0.5mmol/l pmsf和50mmol/l tris-hcl，ph为7.0的混合溶液；

8、e.将第二沉淀与pbs缓冲液混合搅拌，加入十二烷基硫酸钠，搅拌，离心收集上清液；

9、f.向上述上清液中加入十二烷基硫酸钠溶液，搅拌、离心，获得第三沉淀，即波形蛋白前体或未经复性的波形蛋白。

10、在进一步的实施方案中，所述复性的步骤包括：

11、向波形蛋白前体加入复性缓冲液，所述复性缓冲液为100mm tris-hcl、2mm dtt、1mm edta，ph 7.4的混合溶液；室温下搅拌，获得混合溶液a；

12、向混合溶液a中加入羟丙基β-环糊精，使混合溶液中羟丙基β-环糊精终浓度为4～10mm；在室温条件下反应，反应时间不低于40min，获得混合溶液b；

13、超滤离心混合溶液b，获得超滤浓缩液；以及将超滤浓缩液收集于透析袋中，透析之后进行冻干保存。

14、在优选的实施方案中，混合溶液a中羟丙基β-环糊精终浓度为8～10mm；更优选的实施方案中，混合溶液中羟丙基β-环糊精终浓度为10mm。

15、优选的实施方案中，反应时间不低于60min；更优选的实施方案中，反应时间为60～100min。

16、优选的实施方案中，波形蛋白前体中加入复性缓冲液的比例为1mg：10ml。

17、进一步的实施方案中，e步骤中pbs缓冲液浓度为0.01mol/l，十二烷基硫酸钠(sds)溶液的浓度为50mmol/l。

18、进一步的实施方案中，f步骤中十二烷基硫酸钠(sds)溶液的浓度为1～50mmol/l，优选实施方案中，为10～20mmol/l。

19、(2)如(1)所述波形蛋白在促进t淋巴细胞增殖的应用。

20、本申请提供的促进t淋巴细胞增殖功能的波形蛋白及应用的技术效果将在发明实施例中具体阐明。

技术特征：

1.一种具有生物活性的波形蛋白，所述波形蛋白分子量为53.6kd，所述波形蛋白通过提取以及复性的步骤获得；其中，所述提取步骤包括：

2.根据权利要求1所述的波形蛋白，其中，所述复性步骤包括：

3.根据权利要求2所述的波形蛋白，其中，混合溶液a中羟丙基β-环糊精终浓度为8～10mm。

4.根据权利要求3所述的波形蛋白，其中，混合溶液中羟丙基β-环糊精终浓度为10mm。

5.根据权利要求2所述的波形蛋白，其中，反应时间不低于60min。

6.根据权利要求5所述的波形蛋白，其中，反应时间为60～100min。

7.根据权利要求1～6任一项所述的波形蛋白，其中，波形蛋白前体中加入复性缓冲液的比例为1mg：10ml。

8.根据权利要求1～7任一项所述的波形蛋白，其中，e步骤中pbs缓冲液浓度为0.01mol/l，十二烷基硫酸钠溶液的浓度为50mmol/l；f步骤中十二烷基硫酸钠溶液的浓度为1～50mmol/l，优选地，为10～20mmol/l。

9.根据权利要求1～8任一基所述的波形蛋白，其中，新鲜猪脑加入第一盐溶液的比例为1g：10ml；第一沉淀重悬于第二盐溶液的比例为1g：5ml。

10.权利要求1～9任一项波形蛋白在促进t淋巴细胞增殖的应用。

技术总结
本申请公开了具有生物活性的波形蛋白及应用，属于活性蛋白制备技术领域。该波形蛋白分子量为53.6KD，通过波形蛋白前体的提取以及将提取的波形蛋白前体进行复性的方法获得。波形蛋白前体进行复性的过程中，通过向波形蛋白前体加入羟丙基β‑环糊精，由于羟丙基β‑环糊精具有“内疏水”、“外亲水”的特殊分子结构，使其能作为“主体”包合不同的“客体”化合物，形成结构特殊的包合物从而竞争性的与表面活性剂结合，最终达到使蛋白质具有重折叠，恢复蛋白活性。实验证结果表明，羟丙基β‑环糊精浓度为6～10mM，反应时间不低于60min的条件下，其获得的波形蛋白具备较强的促进T淋巴细胞增殖等功能。

技术研发人员：曾云乾,方成
受保护的技术使用者：武汉轻工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15