一种基于CRISPR-Cas12a的猪肠道冠状病毒快速检测方法

本发明属于生物，特别涉及一种基于crispr-cas12a的猪肠道冠状病毒快速检测方法。

背景技术：

1、猪肠道冠状病毒是一类有囊膜包被的单股正链rna病毒，目前已发现的猪肠道冠状病毒包括猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，tgev)、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，pedv)、猪德尔塔冠状病毒(porcinedeltacoronavirus，pdcov)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(swineacute diarrheasyndrome coronavirus，sads-cov)。猪肠道冠状病毒能引起猪胃肠道相关疾病，导致新生仔猪严重腹泻和高死亡率，给我国养猪业带来了严重的经济损失。引起猪腹泻的这四种冠状病毒结构相似，且造成的临床症状和病理特征很接近，仅靠肉眼很难判断由何种病毒感染，这增加了猪肠道冠状病毒的确诊和防控。目前有几种标准的检测方法如病毒分离、病毒中和实验等，这些方法实验周期长，不适合同时检测多个样品。聚合酶链反应(pcr)和实时荧光定量pcr虽然能大大缩短检测时间，但需要昂贵的仪器才能完成检测。

2、由成簇的规律的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspacedshort palindromic repeats，crispr)和crispr相关蛋白(crispr associated proteins，cas)组成的系统被称为crispr-cas系统。在过去的十年中，crispr-cas系统因其能非常有效、快速、简单和廉价地实现细胞敲除基因而引发了基因编辑革命。crispr-cas系统的免疫反应大致分为免疫获得、表达和免疫干预三个阶段。在免疫获得阶段，cas蛋白检测外来核酸以获得新的间隔序列，并将其整合到自身crispr阵列中；第二阶段表达crispr阵列，转录crrna前体(pre-crrna)，并加工为成熟的crrna；在最后阶段，与侵入的核酸相对应的crrna跟一种或多种cas蛋白组装形成crrna核糖核蛋白(crrnp)效应复合物，识别特定位点并对外来核酸进行切割。

3、因此，一种快速、易操作、crispr-cas12a系统因其具有体外无差别地切割附近的非靶单链dna的特性，近年来在体外诊断领域成为研究热点。但目前仍鲜有crispr-cas12a系统检测猪肠道冠状病毒的相关研究。

技术实现思路

1、本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于crispr-cas12a的猪肠道冠状病毒快速检测方法。

2、本发明的另一目的在于提供一种基于crispr-cas12a的猪肠道冠状病毒快速检测试剂盒。

3、本发明的目的通过下述技术方案实现：

4、一种非诊断目的的基于crispr-cas12a的猪肠道冠状病毒快速检测方法，包括以下步骤：

5、提取待检测样本的核酸，进行重组酶聚合酶等温扩增(rt-rpa)反应；将rt-rpa反应产物作为模板进行crispr-cas12a反应，判断荧光值是否大于等于阈值，若是，则为阳性，若否，则为阴性。

6、进一步地，所述的检测样本为猪肠道组织或拭子样品；更进一步地，所述的拭子样品为肝拭子样品。

7、进一步地，所述的提取待检测样本的核酸，包括以下步骤：

8、(1)样品预处理：

9、当样品为猪肠道组织时，用含青霉素和链霉素的pbs缓冲液冲洗观察选取肠壁变薄、有水样内容物的典型病变肠段，将其剪断后放入含青霉素和链霉素的dmem培养基中，冷冻破碎，冷冻离心，取上清过滤除菌；

10、当样品为拭子样品时，加入pbs缓冲液混匀，离心，取上清液；

11、(2)将预处理后的样品使用magen公司的病毒总核酸快速提取试剂盒(rapureviral rna/dna kit)进行提取。

12、进一步地，所述的rt-rpa反应所用的引物对具体如下：

13、当检测猪流行性腹泻病毒(pedv)时，引物对为：

14、pedv-f1：tggtaatgtaaaaccccagagaaagaaggaaa；和

15、pedv-r1：atttcctgtatcgaagatctcgttgataattt；

16、当检测猪急性腹泻综合征冠状病毒(sads-cov)时，引物对为：

17、sads-cov-f3：acacaagctgcactagcctttggtagtgaaat；和

18、sads-cov-r5：gagtgaacactggggcatcagcatttaggtct。

19、当检测猪德尔塔冠状病毒(pdcov)时，引物对为：

20、pdcov-f5：gggtatggctgatcctcgcatcatggctcta；和

21、pdcov-r1：gcgcatccttaagtctctcatagtcaggagaa。

22、当检测猪传染性胃肠炎病毒(tgev)时，引物对为：

23、tgev-f4：aacaagctgttcttgccgcacttaaaaagtta；和

24、tgev-r4：tgtcacatcacctttacctgcagttctcttcc。

25、进一步地，所述的crispr-cas12a反应所用的crrna具体如下：

26、当检测pedv时，crrna为：pedvcrrna3：

27、uaauuucuacuaaguguagaugaaugggacacagcuguugaugg；

28、当检测sads-cov时，crrna为：sads-covcrrna1：

29、uaauuucuacuaaguguagaugaguaagccgagacuugcucaag；

30、当检测pdcov时，crrna为：pdcovcrrna3：

31、uaauuucuacuaaguguagaugcuggccaccuugagagcaacuu；

32、当检测tgev时，crrna为：tgevcrrna3：

33、uaauuucuacuaaguguagaugaacgagagcguugcuguuguuu。

34、进一步地，所述的rt-rpa反应的反应体系为：buffer a、浓度为10μm的上游引物、浓度为10μm的下游引物、rnase-free water、buffer b和待检测样本的rna；更进一步为按体积百分比：58.8％ buffer a、4％浓度为10μm的上游引物、4％浓度为10μm的下游引物、24.2％ rnase-free water、5％ buffer b和4％待检测样本的rna。所述的buffer a和bufferb为安普未来公司的rna快速恒温扩增试剂盒中的试剂。

35、进一步地，所述的rt-rpa反应的恒温反应温度为：40-45℃；更进一步为42℃。

36、进一步地，所述的crispr-cas12a反应的反应体系为：nebuffer 2.1、rna酶抑制剂、浓度为1μm的ssdnareporter、crrna、浓度为500nm的cas12a核酸酶、浓度为1μg/μl的rt-rpa反应产物和rnasefreewater；更进一步为按体积百分比：10％ nebuffer 2.1、2.5％rna酶抑制剂、25％浓度为1μm的ssdnareporter、5％浓度为1μm的crrna、10％浓度为500nm的cas12a核酸酶、5％浓度为1μg/μlrt-rpa反应产物和42.5％ rnasefreewater。

37、进一步地，所述的crispr-cas12a反应在酶标仪中进行。

38、进一步地，所述的荧光值为crispr-cas12a反应15min时的荧光值。

39、进一步地，所述的阈值具体如下：当检测pedv时，阈值为：1.57×104；当检测sads-cov时，阈值为：2.19×104；当检测pdcov时，阈值为：3.07×104；当检测tgev时，阈值为：1.64×104。

40、一种基于crispr-cas12a的猪肠道冠状病毒快速检测试剂盒，包括rt-rpa反应所用的引物和crispr-cas12a反应所用的crrna；

41、所述的rt-rpa反应所用的引物对具体如下：

42、当检测猪流行性腹泻病毒(pedv)时，引物对为：

43、pedv-f1：tggtaatgtaaaaccccagagaaagaaggaaa；和

44、pedv-r1：atttcctgtatcgaagatctcgttgataattt；

45、当检测猪急性腹泻综合征冠状病毒(sads-cov)时，引物对为：

46、sads-cov-f3：acacaagctgcactagcctttggtagtgaaat；和

47、sads-cov-r5：gagtgaacactggggcatcagcatttaggtct。

48、当检测猪德尔塔冠状病毒(pdcov)时，引物对为：

49、pdcov-f5：gggtatggctgatcctcgcatcatggctcta；和

50、pdcov-r1：gcgcatccttaagtctctcatagtcaggagaa。

51、当检测猪传染性胃肠炎病毒(tgev)时，引物对为：

52、tgev-f4：aacaagctgttcttgccgcacttaaaaagtta；和

53、tgev-r4：tgtcacatcacctttacctgcagttctcttcc。

54、所述的crispr-cas12a反应所用的crrna具体如下：

55、当检测pedv时，crrna为：pedvcrrna3：

56、uaauuucuacuaaguguagaugaaugggacacagcuguugaugg；

57、当检测sads-cov时，crrna为：sads-covcrrna1：

58、uaauuucuacuaaguguagaugaguaagccgagacuugcucaag；

59、当检测pdcov时，crrna为：pdcovcrrna3：

60、uaauuucuacuaaguguagaugcuggccaccuugagagcaacuu；

61、当检测tgev时，crrna为：tgevcrrna3：

62、uaauuucuacuaaguguagaugaacgagagcguugcuguuguuu。

63、进一步地，所述的试剂盒还包括rt-rpa反应体系和crispr-cas12a反应体系；更进一步地，所述的rt-rpa反应体系包括buffer a、浓度为10μm的上游引物、浓度为10μm的下游引物、rnase-free water和buffer b，所述的crispr-cas12a反应体系包括nebuffer 2.1、rna酶抑制剂、浓度为1μm的ssdnareporter、crrna、浓度为500nm的cas12a核酸酶和rnasefreewater；所述的buffer a和bufferb为安普未来公司的rna快速恒温扩增试剂盒中的试剂。

64、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

65、本发明将rt-rpa技术与crispr-cas系统结合，针对4种猪肠道冠状病毒的n基因设计crrna，成功建立基于crispr-cas12a的猪肠道冠状病毒的检测方法，该方法的检测灵敏度可低至每微升2×100拷贝，还有高特异性、高灵敏性等特点，在临床检测、临床研究中具有巨大的潜能和良好的发展前景，对病原体的早期诊断和预防控制的研究有着重要意义。