一种PDGF因子的纯化方法与流程

本发明涉及生物，具体为一种pdgf因子的纯化方法。

背景技术：

1、血小板衍生生长因子简称pdgf——血小板衍生生长因子受体简称pdgfr，信号传导通路(以下简称pdgf-pdgfr信号传导通路)的活跃表达与肝癌、胃癌、乳腺癌和肺癌等实体瘤的发生和发展具有一定的相关性，提示阻断pdgf-pdgfr信号传导通路将有助于肿瘤的治疗，用于肿瘤和纤维化疾病治疗的由47个氨基酸组成的多肽pdgfr抑制剂(以下简称p47)，现有采用固相合成的方法合成p47粗肽，在合成结束后将使用适宜的切割液对多肽-树脂进行切割以使粗肽与树脂分离并去除粗肽侧链上的保护基，经过洗涤、干燥后获得多肽含量在20％-70％的粗肽，而可用于临床的药用多肽，其含量通常应达到95％以上，为了提高多肽的纯度，有效去除空心肽、催化剂等杂质，本领域最常用的办法是使用适宜的溶剂例如醋酸水溶液、醋酸乙腈水溶液等进行溶解后，利用反相hplc技术进行纯化。

2、现有的可用于临床的药用p47，其多肽含量通常应达到95％以上，因此需要利用反相hplc技术进行提纯纯化，反相hplc具有很高的分辨率，但是存在反复使用易使压强增高、盐成分对填料损伤较大等问题，因此需要引入新的方法对多肽进行预处理后再利用反相hplc进行精制。

3、于是，有鉴于此，针对现有的结构及缺失予以研究改良，提出一种pdgf因子的纯化方法。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种pdgf因子的纯化方法，解决了上述背景技术中提出的问题。

2、为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种pdgf因子的纯化方法，所述pdgf因子的纯化方法包括下述操作步骤：

3、s1、粗制p47溶液：

4、起始物料为采用固相合成方法获得的多肽-树脂，经过适宜的切割剂将多肽从树脂上切割并切除侧链保护基的粗肽，该粗肽经过乙醚洗涤并充分干燥，采用阴离子交换树脂进行粗提，溶解p47粗肽，使用平衡液a平衡离子交换树脂，上样进行吸附，使用平衡液b平衡并去除杂质，使用洗脱液洗脱获得粗制p47溶液；

5、s2、反相色谱柱纯化操作：

6、利用反相色谱对粗制p47溶液加以第一次纯化，且为防止固定相在高比例水相体系中固定相塌陷的状况，对色谱柱中的硅胶表面加以亲水化修饰，纯化后获得a型p47溶液；

7、s3、反相hplc精制：

8、利用反相hplc对a型p47溶液进行精制，以十八烷基硅胶为固定相，使用平衡液c平衡，将a型p47溶液上样，以醋酸乙腈水溶液作为流动相进行洗脱，收集主峰既得精制p47溶液；

9、s4、p47纯品获得：

10、去除精制p47溶液中的有机溶液，随后将其置于冷冻干燥机进行真空冷冻干燥得到干燥的p47纯品。

11、进一步的，所述s1步骤中，粗制p47溶液获得后置于4摄氏度的旋转机中高速旋转30min，随后取出旋转后的粗制p47溶液置于冰上，在打开超声波细胞破碎机，功率随产品种类进行设定，根据说明书进行操作，超声时间控制在4s，间隔为8s，10min后取出粗制p47溶液。

12、进一步的，所述s1步骤中，平衡液a采用碱性溶液，ph值为9.5-11.5，而平衡液b采用含盐碱性溶液，离子浓度为50-200mmol/l。

13、进一步的，所述s1步骤中，洗脱液为酸性溶液，ph值为3.5-4.5。

14、进一步的，所述s2步骤中，亲水化修饰包括采用非封尾的短链烷基、在固定相中嵌入亲水或极性基团、在烷基与硅胶间插入极性基团、采用长链烷基以及采用大孔硅胶作为固相载体。

15、进一步的，所述s2步骤中，色谱柱在装柱前需要将空气用加压的方法将空气排干，以避免柱中有空气留存。

16、进一步的，所述s2步骤中，通过反相色谱可去除粗制p47溶液中的盐类杂质。

17、进一步的，所述s3步骤中，醋酸乙腈水溶液作为流动相进行洗脱的洗脱方式为梯度洗脱，从0-180min的乙腈浓度(v/v)为5％-95％。

18、进一步的，具有同样效果的洗脱方案还包括分步洗脱，亦分为三个阶段，乙腈浓度(v/v)分别为：浓度1％-10％，时间5-50min、浓度11％-45％，时间5-50min、浓度46％-90％，时间10-100min。

19、本发明提供了一种pdgf因子的纯化方法，具备以下有益效果：

20、1.该pdgf因子的纯化方法，利用反相色谱柱纯化操作对粗制p47溶液加以第一次纯化，以去除粗制p47溶液中的盐类杂质，从而减少反相hplc精制的操作次数，由此避免压强增高、盐成分对填料损伤较大等问题，且色谱柱中的硅胶表面加以亲水化修饰，通过采用非封尾的短链烷基、在固定相中嵌入亲水或极性基团、在烷基与硅胶间插入极性基团、采用长链烷基以及采用大孔硅胶作为固相载体中的一种方式，可以使硅胶表面的亲水性更强，从而可以有效防止高比例水相体系中固定相塌陷的发生。

技术特征：

1.一种pdgf因子的纯化方法，其特征在于：所述pdgf因子的纯化方法包括下述操作步骤：

2.根据权利要求1所述的一种pdgf因子的纯化方法，其特征在于：所述s1步骤中，粗制p47溶液获得后置于4摄氏度的旋转机中高速旋转30min，随后取出旋转后的粗制p47溶液置于冰上，在打开超声波细胞破碎机，功率随产品种类进行设定，根据说明书进行操作，超声时间控制在4s，间隔为8s，10min后取出粗制p47溶液。

3.根据权利要求1所述的一种pdgf因子的纯化方法，其特征在于：所述s1步骤中，平衡液a采用碱性溶液，ph值为9.5-11.5，而平衡液b采用含盐碱性溶液，离子浓度为50-200mmol/l。

4.根据权利要求1所述的一种pdgf因子的纯化方法，其特征在于：所述s1步骤中，洗脱液为酸性溶液，ph值为3.5-4.5。

5.根据权利要求1所述的一种pdgf因子的纯化方法，其特征在于：所述s2步骤中，亲水化修饰包括采用非封尾的短链烷基、在固定相中嵌入亲水或极性基团、在烷基与硅胶间插入极性基团、采用长链烷基以及采用大孔硅胶作为固相载体。

6.根据权利要求1所述的一种pdgf因子的纯化方法，其特征在于：所述s2步骤中，色谱柱在装柱前需要将空气用加压的方法将空气排干，以避免柱中有空气留存。

7.根据权利要求1所述的一种pdgf因子的纯化方法，其特征在于：所述s2步骤中，通过反相色谱可去除粗制p47溶液中的盐类杂质。

8.根据权利要求1所述的一种pdgf因子的纯化方法，其特征在于：所述s3步骤中，醋酸乙腈水溶液作为流动相进行洗脱的洗脱方式为梯度洗脱，从0-180min的乙腈浓度(v/v)为5％-95％。

9.根据权利要求8所述的一种pdgf因子的纯化方法，其特征在于：具有同样效果的洗脱方案还包括分步洗脱，亦分为三个阶段，乙腈浓度(v/v)分别为：浓度1％-10％，时间5-50min、浓度11％-45％，时间5-50min、浓度46％-90％，时间10-100min。

技术总结
本发明公开了一种PDGF因子的纯化方法，涉及生物技术领域，所述PDGF因子的纯化方法包括下述操作步骤：S1、粗制P47溶液；S2、反相色谱柱纯化操作；S3、反相HPLC精制和S4、P47纯品获得。该PDGF因子的纯化方法，利用反相色谱柱纯化操作对粗制P47溶液加以第一次纯化，以去除粗制P47溶液中的盐类杂质，从而减少反相HPLC精制的操作次数，由此避免压强增高、盐成分对填料损伤较大等问题，且色谱柱中的硅胶表面加以亲水化修饰，通过采用非封尾的短链烷基、在固定相中嵌入亲水或极性基团、在烷基与硅胶间插入极性基团中的一种方式，可以使硅胶表面的亲水性更强，从而可以有效防止高比例水相体系中固定相塌陷的发生。

技术研发人员：吴菲
受保护的技术使用者：武汉冉谷医疗有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14