检测先天性血小板缺陷的引物组合物、试剂盒及方法与流程

本发明属于生物，特别涉及血小板发育研究领域，具体涉及检测先天性血小板缺陷的引物组合物、试剂盒及方法。

背景技术：

1、先天性血小板缺陷是一类少见的遗传性疾病，具体包括血小板无力症、遗传性血小板减少症、巨大血小板综合症等疾病，主要是由于巨核细胞分化产板、血小板骨架发育、血小板颗粒形成以及血小板信号转导过程中相关基因发生致病突变导致血小板数量减少和/或功能异常，大多数呈常染色体隐性遗传，往往自幼即有出血倾向。

2、常规的实验室诊断方法仅有形态学或者血常规检测：形态学方法仅能主观上初步判断血小板的体积大小或是巨核细胞的形态异常，但是缺乏特征性指标或者判断标准；血常规中包含的血小板计数、平均血小板体积以及血小板压积等指标亦不能够满足对此类疾病的诊断要求，尤其是在血小板数量较低的情况时，血小板相关量化指标可能存在失真。此外血小板相关功能实验操作繁琐复杂，对于标本采集和质量要求极高，并且仍然存在很大误诊或漏诊的可能。

3、近年来，对于先天性血小板缺陷分子发病基础研究取得了显著进展，目前已知的主要关于先天性血小板缺陷的致病基因有40余种。

4、通过基因检测能够快速有效的对疾病进行诊断并作出分型，其中分子生物学的实验方法主要有pcr、一代测序等。杜燕华等(实时荧光pcr法与elisa法在发热伴血小板减少综合征病例检测中的比较[j]，中国人兽共患病学报，2013，29(1):101-104)公开了实时荧光pcr法在发热伴血小板减少综合征病例检测中的应用，对发热伴血小板减少综合征监测病例的急性期血清，分别应用实时荧光pcr法和elisa-igm方法进行检测，结果143例病例经实时荧光pcr法检测，阳性率50.35％，经elisa-igm法检测，阳性率为37.76％，两种方法的检测有统计学意义(p<0.05)。对于间隔时间超过1w的病例，两种检测方法无统计学意义(p>0.05)，数据表明实时荧光pcr法更适合于发热伴血小板减少综合征病例的早期实验室诊断，且pcr方法不能直观的得到具的突变序列；一代测序的方法受到测序通量的影响，无法一次性检测多个基因的全部外显子区域，而二代测序作为一种高通量的检测方法，可以一次性准确检测多个基因的外显子以及相关序列，使精准诊断先天性血小板缺陷成为可能。当前虽然先天性血小板缺陷突变基因及位点众多，但是现已知的突变位点较少，缺少使先天性血小板缺陷基因诊断的更加全面、覆盖面更广的突变位点及其检测试剂盒。

技术实现思路

1、除非上下文另有明确指示，否则如本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括单数和复数指示物。通过端点表述的数值范围包括在对应范围内的所有数值和分数，以及所表述的端点。

2、本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种检测先天性血小板缺陷的引物组合物、试剂盒及方法。包含该引物组合物的试剂盒能够更加全面的诊断先天性血小板缺陷相关基因突变的基因群，结合二代测序技术，操作更方便，精确度、准确性和灵敏度更高。

3、为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

4、一方面，本发明提供了一组检测先天性血小板缺陷基因的突变位点的引物组合物，所述的突变位点位于acbd5、actn1、ankrd26、ano6、ap3b1、bloc1s3、bloc1s6、cycs、dtnbp1、etv6、fermt3、gata1、gfi1b、gnas、gne、gp1ba、gp1bb、gp6、gp9、hoxa11、hps1、hps3、hps4、hps5、hps6、itga2b、itgb3、lyst、mastl、mpl、myh9、nbea、nbeal2、orai1、p2ry12、pla2g4a、prkacg、rasgrp2、rbm8a、runx1、stim1、stxbp2、tbxa2r、tbxas1、thpo、tubb1、vipas39、vps33b、was共49个基因上；所述的引物组合物由表1所示引物组成。

5、表1检测先天性血小板缺陷基因的突变位点的引物组合物

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31、具体地，所述引物组合物中的每条引物浓度为100nm。

32、优选地，所述的引物组合物能够扩增上述的突变位点中的至少一个。具体地，所述的突变位点信息如表2所示：

33、表2突变位点信息

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42、本发明还提供了一种上述的引物组合物在制备检测先天性血小板缺陷基因的试剂盒中的应用。

43、本发明还提供了一种检测先天性血小板缺陷基因的试剂盒，所述的试剂盒包括上述的引物组合物。

44、优选地，所述的试剂盒还包括将基因组dna制成可供测序的文库的试剂。

45、优选地，所述的试剂盒还包括用于二代测序的试剂。

46、优选地，所述的试剂盒还包括dna聚合酶、缓冲液、ddh2o、dntp。

47、再一方面，本发明提供了一种检测先天性血小板缺陷基因的方法，所述的方法包括利用上述的试剂盒对待测样品中先天性血小板缺陷基因进行检测。

48、所述的方法为非疾病诊断和治疗方法。

49、优选地，所述的方法，包括以下步骤：

50、s1、样品基因组dna提取；

51、s2、对步骤s1中的dna进行pcr扩增；

52、s3、文库构建；

53、s4、文库测序及数据处理分析。

54、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

55、(1)利用本发明提供的与先天性血小板缺陷相关基因突变的基因群，结合高通量测序技术，可以实现在骨髓形态学和血常规检查之外对先天性血小板缺陷进行辅助诊断，特别是对于疾病后续的治疗方向和效果做出预判具有特殊的优势，可弥补临床先天性血小板缺陷在分子诊断、疾病演变、治疗、预后、用药指导方面的不足。

56、(2)本发明中的引物组合物能够检测先天性血小板缺陷基因，具有操作简便，精确度、准确性、灵敏度高优点，解决了目前检测准确性低，检测方法局限的技术缺陷。

57、(3)本发明中的引物组合物可一次性检测所述49个基因的1075个基因突变位点，覆盖面广，检测效率高。

技术特征：

1.一组检测先天性血小板缺陷基因的突变位点的引物组合物，其特征在于：所述的突变位点位于acbd5、actn1、ankrd26、ano6、ap3b1、bloc1s3、bloc1s6、cycs、dtnbp1、etv6、fermt3、gata1、gfi1b、gnas、gne、gp1ba、gp1bb、gp6、gp9、hoxa11、hps1、hps3、hps4、hps5、hps6、itga2b、itgb3、lyst、mastl、mpl、myh9、nbea、nbeal2、orai1、p2ry12、pla2g4a、prkacg、rasgrp2、rbm8a、runx1、stim1、stxbp2、tbxa2r、tbxas1、thpo、tubb1、vipas39、vps33b、was共49个基因上；所述的引物组合物如下所示

2.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于：所述的引物组合物能够扩增权利要求1所述的突变位点中的至少一个。

3.权利要求1或2所述的引物组合物在制备检测先天性血小板缺陷基因的试剂盒中的应用。

4.一种检测先天性血小板缺陷基因的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括权利要求1或2所述的引物组合物。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括将基因组dna制成可供测序的文库的试剂。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括用于二代测序的试剂。

7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括dna聚合酶、缓冲液、ddh2o、dntp。

8.一种检测先天性血小板缺陷基因的方法，其特征在于：所述的方法包括利用权利要求4所述的试剂盒对待测样品中先天性血小板缺陷基因进行检测。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：包括以下步骤：

技术总结
本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种检测先天性血小板缺陷的引物组合物、试剂盒及方法，该引物组合物能够检测先天性血小板缺陷基因的1075个突变位点的至少一个，所述的1075个突变位点位于49个基因上。该引物组合物能够检测先天性血小板缺陷基因，具有操作简便，精确度、准确性、灵敏度高优点，解决了目前检测准确性低，检测方法局限的技术缺陷，且该引物组合物可一次性检测所述49个基因的1075个基因突变位点，覆盖面广，检测效率高。

技术研发人员：汝昆,王哲,蔺亚妮
受保护的技术使用者：天津见康华美医学诊断技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15