基因III型禽呼肠孤病毒变异株及其在制备疫苗中的应用

本发明涉及一株分离得到的基因iii型禽呼肠孤病毒变异株，还涉及该变异株在制备疫苗中的应用。本发明属于生物。

背景技术：

1、禽呼肠孤病毒（avian reovirus，arv）的感染情况近年来在我国日益严峻，arv感染可引发鸡病毒性关节炎、腱鞘炎、吸收不良综合征等疾病，导致鸡群出现免疫抑制、生产性能降低以及饲料利用率和转化率降低，严重影响商品鸡增重，给我国养禽业造成巨大经济损失。

2、arv是一种无包膜双链rna病毒，其基因组由10个节段组成，与其它基因节段相比，s1基因片段中的σc基因是基因组中最易变的区域，负责病毒与细胞的吸附和诱导产生针对病毒的特异性中和抗体，σc基因通常被用作arv流行毒株分型的遗传标记。根据其遗传进化分析，arv毒株可分为6种基因型。

3、疫苗免疫是预防和控制arv感染最有效手段，当前市售疫苗均基于基因ⅰ型毒株制备（如s1133、1733和2408），但长期疫苗免疫压力和集约化养殖密度，使病毒不断发生变异，有研究报道目前市场上销售的疫苗已不能为变异毒株提供完全免疫保护。因此，迫切需要了解国内arv变异株的流行状况，研究其致病性,评价当前市售疫苗对其免疫保护效果等，以期对arv的综合防控起到一定的指导作用。

4、本发明发明人从黑龙江省某企业送检的病鸡关节组织中成功分离到1株基因iii型arv变异毒株，这对我们全面了解arv的流行新态势，开展新型疫苗储备研究，保护养殖业的可持续健康发展具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一株经分离得到的基因iii型禽呼肠孤病毒变异株及其在制备灭活疫苗中的应用。

2、为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

3、2021年，在黑龙江省某肉鸡企业（已接种市售arv疫苗）中，多批已产生高水平arv抗体的商品肉鸡出现跛行、跗关节肿胀/变形等典型arv特征症状，利用lmh（leghorn malechicken hepatocellular carcinoma，lmh）细胞成功分离到了一株禽呼肠孤病毒株（arv-hlj21-1690401），并揭示了其生物学特性和遗传特征。σc基因遗传进化分析显示，本发明分离的毒株为arv变异株，与已报道的基因ⅲ型参考株isr5233和42563-4-2005同源性最高，处于同一进化分支，而与arv其它基因型毒株同源性较低；与疫苗株s1133σc基因核苷酸及其编码氨基酸序列同源性分别为58.5%和50.8%，提示该分离毒株与市售疫苗株之间存在较大的抗原变异。据文献报道，当病毒株与疫苗株之间的氨基酸差异达到或超过5%时，交叉保护效应将减弱。本发明鉴定的arv-hlj21-1690401变异株与当前市售商品化疫苗株s1133主要保护性抗原σc基因编码的氨基酸序列同源性较低，存在明显的抗原性差异，可能已逃逸现有疫苗的保护。lmh细胞传代培养结果表明，该变异株能够在lmh细胞上良好增殖，产生典型的细胞融合病变，病毒复制滴度较高，感染后72 h可达到107.0 tcid50/ml以上。该变异株对鸡胚和spf鸡均具有明显的致病性，可引起接种鸡胚90%死亡，接种6周龄spf雏鸡100%发病，爪垫出现肿胀等arv感染特征性症状。该毒株具有良好的免疫原性，将其制备灭活疫苗，免疫spf鸡可诱导产生较好的抗体水平，并能为同基因型毒株提供完全免疫保护。

4、在上述研究的基础上，首先，本发明提出了一株基因iii型禽呼肠孤病毒变异株，命名为arv-hlj21-1690401，分类命名为禽呼肠孤病毒，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为：cgmcc no. 45563，保藏时间为：2023年4月25日。

5、其次，本发明还提出了所述的基因iii型禽呼肠孤病毒变异株在制备预防禽呼肠孤病毒病药物中的应用。

6、其中，优选的，所述的药物为禽呼肠孤病毒灭活疫苗。

7、再次，本发明还提出了一种禽呼肠孤病毒基因iii型灭活疫苗，所述灭活疫苗的有效成分为灭活后的所述的基因iii型禽呼肠孤病毒变异株。

8、最后，本发明还提出了一种制备所述的禽呼肠孤病毒基因iii型灭活疫苗的方法，包括以下步骤：

9、向所述的基因iii型禽呼肠孤病毒变异株的f6代病毒培养液中，加入1‰体积比的甲醛，混合均匀，置于37℃，每1h转动混匀1次，放置24h，得到灭活病毒液；将5% v/v的吐温-80与灭活病毒液按照体积比1：20混匀，混匀后再与白油按体积比1:1.5进行乳化，乳化的具体操作为：先把白油加入乳化瓶中乳化30s，再沿着乳化头缓慢加入病毒混合液，注意不要产生气泡。乳化器调到6档，乳化3min/次，重复三次，乳化后的样品滴至水中，乳化滴5-10s不散开即可。

10、相较于现有技术，本发明的有益效果是：

11、本发明从我国黑龙江省某企业送检的病鸡关节组织中成功分离到1株禽呼肠孤病毒，将其命名为arv-hlj21-1690401，该毒株纯净性良好。σc基因遗传进化分析结果表明，该分离病毒位于arv基因iii型分支，与基因iii型参考毒株isr5233和42563-4-2005遗传距离较近，氨基酸序列同源性分别为83.4%和81.7%，而与其它基因型分离毒株遗传距离较远。该分离毒株在lmh细胞上增殖良好；对鸡胚和spf鸡均具有明显的致病性，可引起接种鸡胚90%死亡，接种6周龄spf鸡100%发病。该毒株具有良好的免疫原性，将其制备灭活疫苗，免疫spf鸡可诱导产生较好的抗体水平，并能为同基因型毒株提供完全免疫保护。本发明的提出为了解我国arv变异株的流行及遗传进化特征提供了重要的理论依据，为我国养禽场对该病的综合防控提供了新的技术手段。

技术特征：

1.一株基因iii型禽呼肠孤病毒（avian reovirus，arv）变异株，命名为arv-hlj21-1690401，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：cgmcc no.45563。

2.权利要求1所述的基因iii型禽呼肠孤病毒变异株在制备预防禽呼肠孤病毒病药物中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的药物为禽呼肠孤病毒灭活疫苗。

4.一种禽呼肠孤病毒基因iii型灭活疫苗，其特征在于，所述灭活疫苗的有效成分为灭活后的权利要求1所述的基因iii型禽呼肠孤病毒变异株。

5.一种制备权利要求4所述的禽呼肠孤病毒基因iii型灭活疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：

技术总结
本发明公开了一株基因III型禽呼肠孤病毒变异株及其在制备疫苗中的应用。本发明从送检的病鸡关节组织中成功分离到1株基因III型禽呼肠孤病毒变异株，命名为ARV‑HLJ21‑1690401，该变异株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.45563。σC基因遗传进化分析结果表明，该变异株位于ARV基因III型分支。该变异株对鸡胚和SPF鸡均具有明显的致病性，可引起接种鸡胚90%死亡，接种6周龄SPF鸡100%发病。将其制备灭活疫苗，免疫SPF鸡可诱导产生较好的抗体水平，并能为同基因型毒株提供完全免疫保护。本发明的提出为预防禽呼肠孤病毒病提供了新的技术手段。

技术研发人员：高立,高玉龙,王笑梅,李凯,刘长军,祁小乐,张艳萍,崔红玉,王素艳,陈运通
受保护的技术使用者：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心）
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13