一种快速转育瑞丰125转基因玉米自交系的方法及应用与流程

本发明涉及育种，尤其涉及一种快速转育瑞丰125转基因玉米自交系的方法及应用。

背景技术：

1、转基因玉米品种选育通常采用回交法。由于转基因遗传转化效率受材料影响较大，通常优良的玉米自交系因转化效率太低而不适合做遗传转化材料，因此转基因性状不能直接通过遗传转化方法导入优良玉米自交系中。另外，特定的玉米转基因事件在玉米基因组上的插入位置是唯一的，具有特异的玉米基因组侧翼序列以及转基因序列，而通过遗传转化的方法将转基因元件转入玉米基因组时，转基因元件整合到玉米基因组上的位置是随机的。因此，转基因玉米自交系一般只能通过回交法获得，即以遗传转化得来的具有特定转基因事件的玉米转基因材料为供体，以优良的非转基因玉米骨干自交系为受体，杂交一代后用受体材料多代杂交，也就是回交法，来获得含有特定转基因性状的优良转基因玉米自交系。

2、常规的回交法主要通过在田间多代种植和筛选来完成。种植供体玉米材料和受体玉米材料，在花期进行授粉杂交，待玉米完全成熟后收获，获得第一代的玉米材料，然后将第一代玉米材料和受体玉米材料继续在田间进行种植，授粉杂交，获得第二代玉米材料，如此重复种植和授粉杂交，并在高世代进行自交，可以在第十代左右获得含有转基因性状纯合基因型转基因玉米自交系，如果一年种植三个世代，需要三年半时间。

3、常规的回交法具有周期长和转基因目标性状选择有一定的假阳性概率等缺点。随着分子标记技术的发展，利用分子标记技术协助回交法进行转基因玉米自交系选育，可以有效的加快选育进度，且对转基因目标性状选择的准确性高，可以在第六代获得含有转基因性状纯合基因型的转基因玉米单株。如果一年种植三个世代，需要两年时间，相比常规的回交方法可以节省四个种植世代，节省一年半时间。

4、然而常规的分子标记辅助选择方法存在检测通量低，成本高，周期仍相对较长的缺点。在商业化转基因育种过程中，需要回交转育大批量的优良玉米骨干自交系，以及每年新选育出来的优良玉米自交系。另外随着目前玉米新品种井喷，大量新品种涌现，玉米新品种的生命周期缩短，因此转基因品种尽快上市可以抢占市场先机，延长品种生命周期，从而对转基因玉米选育速度和质量提高了要求，为此提出一种快速转育瑞丰125转基因玉米自交系的方法及应用。

技术实现思路

1、为解决现有转基因玉米育种效率低、时间长、准确性差等技术问题，本发明提供一种快速转育瑞丰125转基因玉米自交系的方法及应用。

2、本发明采用以下技术方案实现：一种转基因玉米事件检测引物，包括特异性kasp检测引物、侧翼标记kasp检测引物以及纯杂合子检测引物。

3、作为上述方案的进一步改进，所述特异性kasp检测引物包括：sk12-5r-fam、sk12-5r-com、zssiib-1hex和zssiib-1com。

4、作为上述方案的进一步改进，所述侧翼标记kasp检测引物包括检测分布玉米转基因插入点位置的12mb的物理区间内的snp标记位点的引物。

5、作为上述方案的进一步改进，所述纯杂合子检测引物包括taqman探针qsk125r-p、zssiib-p和引物qsk125r-f1、qsk125r-r1、zssiib-3f、zssiib-4r。

6、作为上述方案的进一步改进，所述特异性kasp检测引物用于对玉米植株进行转基因事件的检测。

7、侧翼标记kasp检测引物用于对转基因玉米植株进行转基因插入点的侧翼标记检测。

8、纯杂合子检测引物用于转基因玉米植株的转基因纯合基因型和转基因杂合基因型检测。

9、一种快速转育瑞丰125转基因玉米自交系的方法，包括以下步骤：

10、s1种植供体材料和受体材料，将供体材料和受体材料进行杂交得到杂交f1玉米种子。

11、s2将f1玉米种子进行播种，利用检测引物筛选含有转基因事件的玉米植株a，将筛选后的玉米植株a在授粉期与受体材料进行杂交，得到bc1f1世代的玉米种子。

12、s3将bc1f1玉米种子进行播种，利用检测引物筛选转基因事件存在、背景回复率高、且在左侧或右侧发生重组交换的玉米植株b在授粉期与受体材料进行杂交，得到bc2f1世代的玉米种子。

13、s4将bc2f1玉米种子进行播种，利用检测引物筛选转基因事件存在、背景回复率高，且在左右两侧均发生重组交换玉米植株c在授粉期与受体材料进行杂交，得到bc3f1世代的玉米种子。

14、s5将bc3f1世代的玉米种子进行播种，利用检测引物筛选转基因事件存在，背景回复率高，且在左右两侧进一步发生重组交换的植株进行自交授粉，得到bc3f2世代的玉米种子。

15、s6将bc3f2世代的玉米种子进行播种，利用检测引物对bc3f2世代的玉米植株进行转基因纯杂合基因型检测，对检测出的纯合转基因单株进行自交授粉，从而筛选得到稳定性一致的纯合基因型转基因玉米自交系。

16、作为上述方案的进一步改进，所述步骤s1中，以瑞丰125转基因玉米材料作为供体材料，以优良的非转基因玉米自交系为受体材料进行杂交得到杂交f1玉米种子。

17、步骤s2中，将f1玉米种子进行播种，利用特异性kasp检测引物筛选含有转基因事件的玉米植株a，将筛选后的玉米植株a在授粉期与受体材料进行杂交，得到bc1f1世代玉米种子。

18、步骤s3中，将bc1f1玉米种子进行播种，利用特异性kasp检测引物对玉米幼苗进行检测，确认转基因事件的存在，然后利用侧翼标记kasp检测引物对玉米幼苗进行侧翼标记检测，筛选在转基因插入位置左侧或者右侧发生重组交换的幼苗，然后对发生重组交换的幼苗进行1k snp标记靶向测序panel(包含两侧侧翼snp标记)背景检测，同时再进行侧翼标记检测，挑选转基因事件存在、背景回复率高、且在左侧或右侧发生重组交换的玉米植株b在授粉期与受体材料进行杂交，得到bc2f1世代的玉米种子。

19、作为上述方案的进一步改进，所述步骤s4中，将bc2f1玉米种子进行播种，利用特异性kasp检测引物，对玉米幼苗进行检测，确认转基因事件的存在，然后利用侧翼标记kasp检测引物对玉米幼苗进行检测，筛选在转基因插入位置左右两侧均发生重组交换的幼苗，对发生重组交换的幼苗进行1k snp标记靶向测序panel背景检测，同时再进行侧翼标记检测，挑选背景回复率高，且在左右两侧都发生重组交换的玉米植株c在授粉期与受体材料进行杂交，得到bc3f1世代的玉米种子。

20、作为上述方案的进一步改进，所述步骤s5中，将bc3f1世代的玉米种子进行播种，利用特异性kasp检测引物，对玉米幼苗进行检测，确认转基因事件的存在，然后利用1k snp标记靶向测序panel(包含两侧侧翼snp标记)背景检测，同时再进行侧翼标记检测，挑选背景回复率高，且在左右两侧进一步发生重组交换的幼苗，背景回复率达预期数值时，选择两侧连锁累赘片段最小的植株进行自交授粉。

21、作为上述方案的进一步改进，所述步骤s6中，将bc3f2世代的玉米种子进行播种，利用纯杂合子检测引物对bc3f2世代的玉米植株进行转基因纯杂合基因型检测，对检测出的转基因纯合单株自交授粉获得到稳定性一致的转基因纯合系。

22、作为上述方案的进一步改进，所述步骤s1至s6中采用玉米胚挽救技术加快转基因事件的回交转育进程，其步骤为：在玉米授粉后，将未成熟果穗从玉米植株上取下；在实验室超净工作台上将玉米籽粒幼胚剥出，放置培养基上进行暗培养和光培养，然后移栽到穴盘中，对穴盘中的幼苗叶片取样检测，根据检测结果挑选优良单株移栽到大田。

23、相比现有技术，本发明的有益效果在于：

24、1、本发明利用开发的转基因事件特异性kasp检测引物，可以准确地检测转基因事件是否存在于玉米幼苗中；采用侧翼标记检测kasp引物，可以有效筛选出重组交换单株，减少转基因片段带入的连锁累赘；采用转基因纯杂合子检测引物可以对自交后代进行高通量、准确的纯杂合基因型检测，加速转基因目标性状的纯合。

25、2、本发明利用玉米胚挽救技术，结合分子检测结果，只移栽发生重组交换的幼苗(约总苗数的10％-15％)至大田，节省了85％-90％的种植面积，同时减少后期的田间管理和收获工作；同时应用胚挽救技术，一年可种植四代，完成整个回交转育仅需要一年半年，比不利用胚挽救技术缩短半年时间。

26、3、本发明可以实现同时对100个以上回交群体进行高通量检测，完成一个转基因玉米自交系的回交转育时间相对于常规回交方法，育种年限缩短两年左右，相对于常规分子标记辅助方法，分子检测费用节省80％。

27、4、本发明提供了一套高通量、低成本、快速进行转基因玉米回交转育的技术方案，提高回交转育效率和节省回交转育成本。