本发明属于农业微生物，涉及一种用于防治柑橘溃疡病的复合菌剂制备方法与使用方法。
背景技术：
1、柑橘溃疡病是一种由细菌引起的世界性病害，该病不仅传播速度快，传播范围广，发病时还会影响叶片、枝梢、果实和萼片，导致柑橘大量减产，并且病菌能残留在病果病叶等越冬，造成连年发病，防控困难。我国南方是柑橘主产区，因此深受其害。目前，柑橘溃疡病的研究主要在致病分子机制，抗性机制方面，应用研究太少。而现实生产中，果农们大多选择化学农药来治疗柑橘溃疡病，因而导致了农药残留、环境污染等问题。而生物防治技术虽然绿色环保却没有疗效可靠的产品，也没有便捷有效的施用方法，导致柑橘溃疡病很难得到控制，迫切需要研发新的生防菌剂和防治程序。
技术实现思路
1、为实现上述目的，本发明提供一种用于防治柑橘溃疡病的复合菌剂制备方法与使用方法。复合菌剂由4种可有效抑制柑橘溃疡病病菌的微生物组成：拟无枝酸菌(amycolatopsis sp.，bncc290009)、贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis，bncc352076)、草酸青霉(penicillium oxalicum，bncc146276)、植物乳杆菌(lactobacillus plantarum，bncc134428)。这4种微生物经菌种复壮、种子培养、扩大培养生成发酵液，再按1：1：1：1配成微生物复合菌剂，将该复合菌剂喷洒于正常叶面和病叶表面可有效预防和治疗柑橘溃疡病。
2、为了解决上述问题，本发明的技术方案如下：
3、一种用于防治柑橘溃疡病的复合菌剂制备方法与使用方法，包括制备复合菌剂和预防及治疗柑橘溃疡病的方法。
4、所述复合菌剂包括4种微生物：拟无枝酸菌(amycolatopsis sp.，bncc290009)、贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis，bncc352076)、草酸青霉(penicillium oxalicum，bncc146276)、植物乳杆菌(lactobacillus plantarum，bncc134428)。
5、所述制备复合菌剂，包括以下步骤：种子复壮，种子培养、扩大培养、制备复合菌剂。
6、(1)所述种子复壮，是将拟无枝酸菌、贝莱斯芽孢杆菌分别从保种管接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于恒温震荡培养箱，35-37℃，转速为150-200r/min，培养1-2天，将植物乳杆菌从保种管接种到mrs液体培养基中，置于恒温培养箱，35-37℃，静置培养1-2天，草酸青霉接种到pda液体培养基，置于霉菌培养箱，25-28℃、转速为160-200r/min，培养5-7天。
7、(2)所述的种子培养，是将复壮的种子，接种到种子液体培养基中，液体种子培养基的配方为：2-3％麸皮，2-3％葡萄糖，0.05-0.1％ kh2po4，0.05-0.2％cacl2，0.01-0.03％mgso4·7h2o，0.02-0.1％nacl。接种量为5-10％，接种完的拟无枝酸菌和贝莱斯芽孢杆菌置于恒温震荡培养箱，培养温度35-37℃，转速为150-200r/min，培养1-2天；接种完的植物乳杆菌置于恒温培养箱，培养温度35-37℃，培养1-2天；接种完的草酸青霉置于霉菌培养箱，培养温度25-28℃、真菌培养3-5天。
8、(3)所述的扩大培养，是将制备的种子培养液接种到扩大培养液体培养基中，扩大培养液体培养基的配方为：3-5％麸皮，2-3％葡萄糖，0.05-0.1％ kh2po4，0.05-0.2％cacl2，0.01-0.03％mgso4·7h2o，0.02-0.1％nacl。接种量为2-5％，4种菌的扩大培养条件与其种子培养条件一致。
9、(4)所述制备复合菌剂，将扩大培养的4种菌的菌液按1：1：1：1，进行混合，制得复合菌剂。
10、所述复合菌剂的施用方法，包括预防柑橘溃疡病的方法和治疗柑橘溃疡病的方法。具体操作为：
11、(1)用于预防柑橘溃疡病时，将权利要求7制备的复合菌剂均匀喷施于柑橘溃疡病病叶正反表面，让其在叶面覆上一层薄薄的水膜为宜，连续施用3天则至少可有效预防柑橘溃疡病菌10天感染，之后连续每7天施用1次，可持续有效抑制柑橘溃疡病菌感染。
12、(2)用于治疗柑橘溃疡病时，将权利要求7制备的复合菌剂均匀喷施于柑橘溃疡病病叶正反表面，让其在叶面覆上一层薄薄的水膜为宜，根据发病严重程度决定施用复合菌剂的频次：一般情况下，在感染初期，病株≤10％，叶面刚出现病斑或病斑直径≤2mm，7天喷施一次，可促进病斑的治愈和抑制病菌的传播。在感染传播期，10％＜病株≤50％，2mm＜病斑直径≤5mm，5天喷施一次，可抑制病斑的恶化和病菌的传播。如果大面积发病且病斑直径＞5mm，则3天喷施一次，可达到治疗效果。
13、本发明的有益效果是本发明制备的复合菌剂与传统化学农药相比，安全无毒，不污染土壤和水体，对果农人身安全亦有保障，无不良气味，也不会通过呼吸或皮肤吸收而影响施用者的健康。此外，该复合菌剂的制备工艺简单，成本便宜，预防和治疗的效果都很好，适合应用推广。
1.本发明公开了一种用于防治柑橘溃疡病的复合菌剂制备方法与使用方法，其特征在于，包括制备复合菌剂的组成、复合菌剂的制备方法、复合菌剂用于防治柑橘溃疡病的施用方法。
2.根据权利要求1所述的一种用于防治柑橘溃疡病的复合菌剂制备方法与使用方法，其特征在于，所述制备复合菌剂包括4种微生物：拟无枝酸菌(amycolatopsis sp.，菌株编号bncc290009)、贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis，菌株编号bncc352076)、草酸青霉(penicillium oxalicum，菌株编号bncc146276)、植物乳杆菌(lactobacillus plantarum，菌株编号bncc134428)。
3.根据权利要求1所述的一种用于防治柑橘溃疡病的复合菌剂制备方法与使用方法，其特征在于，所述制备复合菌剂的方法，包括菌剂所含的4种微生物的种子复壮，种子培养、扩大培养、制备复合菌剂。
4.根据权利要求3所述的制备复合菌剂的方法，所述的种子复壮，是将拟无枝酸菌、贝莱斯芽孢杆菌分别从保种管接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于恒温震荡培养箱，35-37℃，转速为150-200r/min，培养1-2天，将植物乳杆菌从保种管接种到mrs液体培养基中，置于恒温培养箱，35-37℃，静置培养1-2天，草酸青霉接种到pda液体培养基，置于霉菌培养箱，25-28℃、转速为160-200r/min，培养5-7天。
5.根据权利要求3所述的制备复合菌剂的方法，所述的种子培养，将根据权利要求4复壮的种子，接种到种子液体培养基中，液体种子培养基的配方为：2-3％麸皮，2-3％葡萄糖，0.05-0.1％kh2po4，0.05-0.2％cacl2，0.01-0.03％mgso4·7h2o，0.02-0.1％nacl。接种量为5-10％，接种完的拟无枝酸菌和贝莱斯芽孢杆菌置于恒温震荡培养箱，培养温度35-37℃，转速为150-200r/min，培养1-2天，接种完的植物乳杆菌置于恒温培养箱，培养温度35-37℃，培养1-2天，接种完的草酸青霉置于霉菌培养箱，培养温度25-28℃、真菌培养3-5天。
6.根据权利要求3所述的制备复合菌剂的方法，所述的扩大培养，将根据权利要求5制备的种子培养液接种到扩大培养液体培养基中，扩大培养液体培养基的配方为：3-5％麸皮，2-3％葡萄糖，0.05-0.1％kh2po4，0.05-0.2％cacl2，0.01-0.03％mgso4·7h2o，0.02-0.1％nacl。接种量为2-5％，接种4种菌的培养条件与其在权利要求5中对应的种子培养条件一致。
7.根据权利要求3所述的制备复合菌剂的方法，所述的制备复合菌剂，将根据权利要求6扩大培养的4种菌的菌液按1：1：1：1，进行混合，制得复合菌剂。
8.根据权利要求1所述的一种用于防治柑橘溃疡病的复合菌剂制备方法与使用方法，其特征在于，所述复合菌剂的施用方法，其特征在于，用于预防柑橘溃疡病时，将权利要求7制备的复合菌剂均匀喷施于柑橘溃疡病病叶正反表面，让其在叶面覆上一层薄薄的水膜为宜，连续施用3天则至少可有效抑制柑橘溃疡病菌10天不受感染，之后连续每7天施用1次，可持续有效抑制柑橘溃疡病菌感染。
9.根据权利要求1所述的一种用于防治柑橘溃疡病的复合菌剂制备方法与使用方法，其特征在于，所述复合菌剂的施用方法，其特征在于，用于治疗柑橘溃疡病时，将权利要求7制备的复合菌剂均匀喷施于柑橘溃疡病病叶正反表面，让其在叶面覆上一层薄薄的水膜为宜，根据发病严重程度决定施用复合菌剂的频次：一般情况下，在感染初期，病株≤10％，叶面刚出现病斑或病斑直径≤2mm，7天喷施一次，可促进病斑的治愈和抑制病菌的传播；在感染传播期，10％＜病株≤50％，2mm＜病斑直径≤5mm，5天喷施一次，可抑制病斑的恶化和病菌的传播；如果大面积发病且病斑直径＞5mm，则3天喷施一次，可达到治疗效果。