一株高产蛋白的裂褶菌菌株及其选育方法与流程

本发明属于食用菌选育，具体涉及一株高产蛋白的裂褶菌菌株及其选育方法。

背景技术：

1、裂褶菌(schizophyllum commune)又称白参、树花、白花、八担柴等，属真菌门(eumycophyta)，担子菌纲(basidiomycetes)，伞菌目(agaricales)，裂褶菌科(schizophyllaceae)，裂褶菌属(shizophyllum)。裂褶菌性平、味甘，能清肝、明目、催乳、滋补强身，并可治疗妇女白带过多、精神不振、头昏耳鸣、虚汗等症状。裂褶菌属珍稀食药用菌，含有裂褶菌多糖、核苷、腺苷、嘌呤等有效成分，且具有显著的强身健体、抗肿瘤、防衰老、抗菌消炎、抗辐射、抗病毒等功效。

2、目前裂褶菌主要通过人工栽培和深层发酵培养两种方式获得，其中，裂褶菌发酵培养具有周期短，产量大的特点。根据专利《裂褶菌的培养工艺及其利用》，专利号cn85103492公开的数据，每升发酵液含200-300g菌丝体(湿重)，但是其产量仍然较低。国外对裂褶菌的遗传、生理研究较早，我国侧重研究菌丝体的发酵条件、人工驯化栽培和药用价值，例如对裂褶菌多糖的研究，但关于裂褶菌蛋白的研究方向较少。专利《真菌发酵饲料生产方法》，专利号cn102008012a中，报道了裂褶菌饲料中的蛋白含量10-16％，多糖8-12％。昆明食用菌在研究所赠予裂褶菌菌株ef-68，其菌丝中所含粗蛋白的质量分数为22-26％，在真菌粗蛋白中是比较高的，本案例将以该菌株作为出发菌株。

3、目前关于裂褶菌的选育报道很少，专利《一株裂褶菌及其驯化栽培方法和应用》，专利号cn 106613350 a中，采用传统的驯化方法对裂褶菌多糖进行提产驯化，该法选育周期长，根据裂褶菌的结果特征，其具有较厚细胞壁结构。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一株高产蛋白的裂褶菌菌株。

2、本发明还要解决的技术问题是提供上述高产蛋白的裂褶菌菌株的选育方法。

3、为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

4、一株高产蛋白的裂褶菌菌株，分类命名为裂褶菌schizophyllum commune，菌株号gxgd-ef-68-r-1，已于2023年04月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为gdmccno：63362，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

5、上述高产蛋白的裂褶菌菌株的选育方法，是将原始裂褶菌活化后培养得到的菌丝体制备成菌丝体悬液，再将制备得到的菌丝体悬液酶解制备原生质体，原生质体经再生培养后再进行artp诱变、初筛、复筛后选育得到高产蛋白的裂褶菌菌株。

6、其中，所述的原始裂褶菌为裂褶菌ef-68，来源于昆明食用菌研究所赠予。

7、其中，所述的原始裂褶菌活化后培养，其培养条件为：25-28℃、100-300rpm条件下，培养5-8d，优选的培养条件为：26℃、150rpm条件下，培养5-8d。

8、其中，所述的菌丝体悬液酶解制备原生质体，其所用的酶体系为m2酶体系，配方为：牛血清蛋白50mg、蜗牛酶50mg、崩溃酶50mg、lysing enzymes 50mg、yatalase50mg、β-glucuronidase 100μl、果胶酶100mg、纤维素酶200μl、稳定剂30ml，ph5.0-6.0；其中，所述的稳定剂配方为：10mm nah2po4、0.8m nacl，ph6.0。(m2酶体系的筛选、制备过程已公开在专利cn115927017a中)

9、其中，所述的菌丝体悬液酶解，其酶解条件为：20-30℃，50-250rpm条件下，酶解1-4h，优选的酶解条件为：30℃，200rpm条件下，酶解3h。

10、其中，所述的再生培养，其再生培养基配方如下：0.6mol/l蔗糖、抗生素50mg/l、土豆汁200g/l、葡萄糖20g/l、磷酸二氢钾3g/l、硫酸镁1.5g/l、vb1 0.1g/l。

11、具体的，所述的抗生素为链霉素、青霉素、青霉素钾盐中的任意一种。

12、其中，所述的artp诱变，其诱变过程使用了诱变保护剂。

13、具体的，所述的诱变保护剂，配方为：2％维生素c、1％超氧化物歧化酶、5％甘油，余量为稳定剂；其中，所述的稳定剂配方为：10mm nah2po4、0.8m nacl，ph6.0。

14、上述高产蛋白的裂褶菌菌株具体的选育方法，包括如下步骤：

15、(1)菌株ef-68生长情况表征：对原菌株ef-68进行活化，制备一级种子液，按照10％(v/v)体积比接入二级种子液配方中，连续10d对其生物量及蛋白含量进行测定表征，确定摇瓶生长拐点。

16、(2)菌丝体悬液的制备：将步骤(1)制备的ef-68菌丝体，按照5-6块/瓶，接入种子液中，26℃、150rpm培养6-8d。然后将灭菌后的10-20颗玻璃珠放入种子液中振荡5-10min后，用孔径为22-25μm的mircloth神奇滤布(calbiochem公司)过滤菌丝团，收集菌丝体悬液，10000rpm、4℃离心10min后，收集菌丝体，用稳定剂冲洗1-2遍，备用。

17、(3)菌丝体酶解制备原生质体：将步骤(2)配置好的菌丝体悬液置于m2酶体系中，30℃，200rpm条件下，酶解3h后，洗涤重悬得到原生质体悬液，备用。

18、(4)原生质体的再生：将原生质体浓度调整到106个/ml，视情况考虑梯度稀释后，取0.1ml原生质体悬液涂布于再生培养基上，观察并计算原生质体的再生率为2.58％，初步筛选获得一株高产菌株ef-68-9。

19、(5)artp诱变：将步骤(4)初步筛选获得的高产菌株ef-68-9作为出发菌株，根据步骤(2)和步骤(3)制备成原生质体悬液。调整原生质体的数量在105-106cfu/ml，取10μl调整后的悬液均匀涂布在灭菌载片表面。在工作功率100w、工作气流10slm、照射距离2mm条件下，设置照射时间0-180s。artp诱变处理完毕后，将样品放置于装有150μl诱变保护剂配方1的2ml离心管中，26℃、黑暗孵育90min后，用磁悬浮震荡仪洗脱震荡，洗脱震荡时间不少于1min，洗脱菌液备用。

20、(6)artp诱变菌株的筛选：将步骤(5)中的洗脱菌液，调整活菌数为50-100cfu/ml后，涂布于再生培养基上，26℃培养5-10d，待再生培养基上长出单菌落后，以菌落生长速率、菌丝体厚度为依据初筛，挑选出一株突变菌株ef-68-r-1作为高产蛋白菌株。

21、进一步的，对上述突变菌株ef-68-r-1进行生长特性表征。具体的，ef-68-r-1菌丝体直径2.88-3.89μm，菌丝体存在锁状联合结构，菌丝出现较多分支结构，菌体之间出现不等距的横隔。对其菌丝体进行测序分析，测序结果如seq id no:1所示，获得660bp大小的片段(由武汉擎科生物技术有限公司进行pcr扩增及测序)。

22、上述高产蛋白的裂褶菌菌株在高产蛋白中的应用也在本发明所保护的范围之内。

23、具体的，对选育出的突变菌株ef-68-r-1进行发酵产量的验证。将原始菌株ef-68与突变菌株ef-68-r-1活化培养后，备用。在两台10l发酵罐中，分别装液5l发酵基础培养基，调ph 5.5，加5ml消泡剂，121℃灭菌20min。将菌株ef-68与突变菌株ef-68-r-1的种子液，分别按10％ v/v接种量接入两台发酵罐。在转速500rpm，通气量0.4m3/l，罐压0.08mpa，ph自控模式(动态保持ph 5.5)条件下，26℃培养。当培养40h后，还原糖降至1-2g/l时，结束发酵，进行固液分离，进行相关生物量及蛋白测定。

24、具体的，所述的高产蛋白的裂褶菌菌株(突变菌株ef-68-r-1)，其生物量干重高达26.21g/l，蛋白含量高达48.13％。

25、上述高产蛋白的裂褶菌菌株在制备畜牧饲料添加剂中的应用也在本发明所保护的范围之内。

26、有益效果：

27、(1)本发明通过对裂褶菌ef-68的生长特性进行表征，并采用本实验自主研发的酶解体系(m2)及相应的原生质体制备流程，筛选出了初筛菌株ef-68-9，其总蛋白提高率达32.47％。以菌株ef-68-9为二次选育出发菌株制备原生质体并再生，进行artp诱变选育获得了一株生长速度快、生物量高、高产蛋白的突变菌株ef-68-r-1，其相对于菌株ef-68-9，总蛋白提高了21.85％。

28、(2)本发明通过对原始菌株ef-68和突变菌株ef-68-r-1进行放大发酵验证，，突变菌株ef-68-r-1相对于原始菌株ef-68，其总蛋白含量提升了87.39％。

29、(3)本发明选育得到的突变菌株ef-68-r-1，其菌株生物量和蛋白含量高，可作为优秀的饲料添加剂，因此在制备高蛋白畜牧饲料添加剂领域具有广阔的应用前景。