本发明涉及肠道菌群提取纯化的，尤其涉及一种通过超纯净化除杂技术而实现肠道菌群高度浓缩富集的方法。
背景技术：
：：1、粪便菌群移植(fecal microbiota transplantation，fmt)是指一种将健康供体的粪便处理后经胃、小肠、结肠等途径移植到患者肠道内，以治疗由肠道菌群失衡而引起的肠道及肠外疾病的疗法。其概念及应用最早可追溯至东晋时期，在我国著名医药学家葛洪的《肘后备急方》中就记载了用粪液治疗食物中毒、腹泻的方法。60年前美国一名医生率先将fmt应用于临床实践。2013年第一篇应用fmt治疗复发性难辨梭菌感染(recurrenceclostridium difficile infection，rcdi)的随机对照试验的发表使得fmt成为临床研究的焦点。2、fmt的治疗机制本质上是通过移植健康人体粪便中的的功能菌群以重建患者的肠道菌群，这不仅仅是改变了患者肠道菌群的群落结构，而且还包括恢复肠道菌群的功能，如对于rcdi的治疗是通过移植健康人体粪便中的的功能菌群从而在患者的肠道中产生抗菌蛋白(细菌素)抑制艰难辨梭菌(clostridiumdifficile，cd)生长的目的，功能菌群还可以激活多种宿主免疫防御，并通过次级胆汁酸抑制cd芽胞萌发和营养生长，此外在抗生素治疗的压力下，肠道很可能成为其他潜在抗生素抗性病原体的储存库，通过fmt恢复正常的微生物群落结构则是保护机体免受这些病原体感染的有效方法。目前fmt在临床上的应用除了上述对rcdi的治疗外，还被逐步应用于对肠易激综合征(irritable bowelsyndrome，ibs)的治疗，由于ibs致病与肠道菌群紊乱关系密切，因此通过fmt治疗可以改善或者减轻ibs患者的症状，同时也有应用fmt治疗急性重症胰腺炎、肝脏疾病如乙型肝炎、精神神经疾病如孤独症谱系障碍等的报道。总的来说，fmt在上述疾病的治疗中显示出良好的重建失衡肠道微生物群的能力。3、虽然fmt已被广泛应用于各类疾病的治疗，但该技术仍存在许多的问题，因为fmt不仅是一种单纯的菌群移植技术，而是囊括了严格的供体筛选、优化的粪便处理方法、科学的菌群移植途径等多种理念和方法学在内的一种新兴的治疗技术体系，而其中优化的粪便处理方法是整个fmt中最为关键且重要的环节，因为粪便中含有大量未消化的食物残渣以及代谢产物，若处理方法不当，一方面会对患者产生不好的体验感，另一方面又会影响最终的治疗效果。但目前关于粪便处理方法尚未有一套标准化的流程，仍处于方法优化阶段，现有报道的粪便处理方法主要有离心法、重悬洗涤法和过滤除杂法，但这些方法均存在一定的弊端，经过处理后的粪便样本仍存在较多杂质，并且异味浓烈、色泽深重，无法达到有效除杂的目的，因此，寻找一种操作简单、处理成本低且能够有效除色除味、提升菌群单位菌量及纯度的方法成为了目前fmt领域中研究和开发的重点。4、吸附树脂是一类具有大孔结构的高分子吸附剂，其理化性质稳定，不溶于酸碱及有机溶剂，不受无机盐类及强离子、低分子化合物的干扰，其吸附性能与活性炭相似，与范德华力或氢键有关，同时，网状结构和高比表面积使得其具有高效的筛选性能。吸附树脂现已广泛应用于天然植物中活性成分的提取分离，如皂苷、黄酮、内脂、生物碱等，在处理工业废水方面也有成功的应用，但将吸附树脂应用于fmt中对粪便的处理鲜有报道。技术实现思路1、为解决上述问题，本发明的首要目的是提供一种通过超纯净化对肠道菌群提取富集的方法，该方法采用动态过柱纯化及摇床吸附等方式，使肠道菌群在单位菌量上均有大幅度的提升，同时活性上也有一定的升高。2、本发明的另一个目的是提供一种通过超纯净化对肠道菌群提取富集的方法，该方法使用多种类型的吸附树脂，如非离子型疏水性交联聚合物吸附树脂、大孔网状芳香聚合物吸附树脂、聚丙烯酸酯型聚合物吸附树脂、苯乙烯型共聚体吸附树脂、离子型吸附树脂中任意一种或任意组合，其具有优异的物理、化学和热稳定性，能稳定存在，并且在溶剂和水介质之间具有低溶胀性，能够提高除杂效率、提升菌群单位菌量、纯度、活性及除色除味。3、本发明的又一个目的是提供一种通过超纯净化对肠道菌群提取富集的方法，该方法不仅为fmt领域中对粪便处理环节提供新的方法，操作简单、处理成本低，还能够应用在污水处理、生态环境保护以及食品、中草药提取等领域。4、为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：5、一种通过超纯净化对肠道菌群提取富集的方法，包括下述步骤：6、步骤1，吸附树脂预处理；7、称取树脂进行湿法装柱，分别在柱中加入去离子水，反洗使床层膨胀除去小粒子和破碎树脂，接着进行盐处理，用nacl浸泡树脂，浸泡完毕后用去离子水冲洗干净；再进行乙醇处理，除去其中的气泡，使树脂充分膨胀收缩，最后去离子水将乙醇冲洗去除，预处理完毕；8、进一步，所述吸附树脂为：非离子型疏水性交联聚合物吸附树脂、大孔网状芳香聚合物吸附树脂、聚丙烯酸酯型聚合物吸附树脂、苯乙烯型共聚体吸附树脂、离子型吸附树脂的任意一种或任意组合。9、更进一步，称取上述任意一种或任意组合的树脂进行湿法装柱，分别在柱中加入去离子水，反洗使床层膨胀70％，除去小粒子和破碎树脂，接着进行盐处理，取10％nacl浸泡树脂，浸泡完毕后用去离子水冲洗干净；再进行醇处理，用70％～80％的乙醇溶液浸泡，除去其中的气泡，使树脂充分膨胀收缩，最后去离子水将乙醇冲洗去除，预处理完毕。10、进一步，称取待使用的树脂进行湿法装柱，分别在柱中加入去离子水，反洗使床层膨胀70％，除去小粒子和破碎树脂，接着进行盐处理，取2bv(1bv＝1个单位的树脂体积)的10％nacl浸泡树脂20小时以上，浸泡完毕后在1-5bv/h的流速下用去离子水冲洗干净，流量在3－6bv之间，进一步地，再进行醇处理，用70％～80％的乙醇溶液浸泡12小时以上，除去其中的气泡，使树脂充分膨胀收缩，流速控制在1－5bv/h，流量在2－4bv之间，最后用3－6bv的去离子水将乙醇冲洗去除，流速控制在1－5bv/h之间，预处理完毕，备用。11、步骤2，粪便样本前处理；12、将粪便样本用生理盐水溶解，涡旋混匀后通过抽滤将大颗粒杂质及食物残渣去除，得到菌悬液；13、步骤3，上样吸附除杂；14、将上述粪便样品的菌悬液利用树脂进行吸附除杂；15、进一步，上样前菌悬液先进行多级过滤预处理，孔径由大到小分别为0.5mm、0.25mm、0.1mm、0.05mm，对菌悬液进行预除杂。16、所述吸附除杂是联合树脂的吸附除杂，所述联合树脂的吸附除杂，是将两种及两种以上树脂以相同的配比湿法装柱，装柱完毕后同样地启动蠕动泵，上样进行吸附除杂，或是将菌悬液置于摇床中进行吸附除杂。17、更进一步，所述吸附除杂中，温度在0-40℃，上样流速为0.5-10bv/h，径高比在1:1-1:8范围内，树脂与菌悬液比例在1:1-1:6(w:v)范围内，预处理筛网孔径在0.05mm-0.5mm范围内，在摇床吸附方式中控制摇床转速为100-500rpm/min，采用的重悬液为生理盐水或pbs缓冲液，吸附时间在2-60min，过滤树脂筛网目数在50-300目范围内。此种条件下，富集效果最好。18、更进一步，所述吸附除杂还包括单一树脂的吸附除杂，所述单一树脂的吸附除杂，将树脂湿法装柱，将导出管置于树脂层上方，运行蠕动泵，将菌悬液上样进行吸附除杂，同时在层析柱出口下方放置锥形瓶，收集过柱后的滤液，即可，在摇床吸附中则是将单一树脂置于摇床中进行吸附除杂，除杂完毕后过滤掉树脂，收集滤液，即可。19、本发明采用吸附树脂，其吸附性能来源于大孔网状结构、连续聚合物相、连续孔相、高表面积和表面芳香性，具有优异的物理、化学和热稳定性，在ph为0-14之间均能稳定存在；同时，结合动态过柱纯化及摇床吸附等方式，对肠道菌群进行富集，对于肠道菌群的富集效率大大提高，在单位菌量上均有大幅度的提升，同时活性上也有一定的升高，此外在色泽及气味的感官评价中也具有较好的表现水平，兼顾了纯化吸附及除色除味的效果。20、本发明进一步包括下述步骤：21、步骤4，样品后处理及检测；22、将样品下离心，去上清，称取沉淀菌泥重量后，再用生理盐水将菌泥稀释并充分涡旋混匀，以此稀释组，可进行多次稀释，然后分别加入生理盐水、1.5μlsyto-9和1.5μl pi染料，涡旋混匀后暗反应，使其充分染色后，进入流式细胞仪测定分析。23、步骤5，数据分析；24、试验数据采用spss 22.0univariate方法单因素分析，对f检验达到显著水平的因子进行方差分析并进行duncan氏组间多重比较，各组试验数据均以平均值±标准差表示，统计显著性水平为p＜0.05。25、步骤6，树脂的再生处理。26、当树脂使用完后，由于其吸附能力降低、杂质负载量较大，因此需要强化再生处理，具体方法如下，加入高于树脂层5cm的2％hcl浸泡12小时，再用1－2倍树脂体积同浓度的盐酸溶液以1bv/h的流速通柱，然后用去离子水以1bv/h的流速洗至接近中性，随后用2％naoh溶液浸泡1－2小时，再用1－2倍树脂体积同浓度的naoh以1bv/h的流速通柱，然后用去离子水以1bv/h的流速洗至接近中性，再生处理完毕。27、与现有技术相比，本发明的有益效果为：28、本发明采用动态过柱纯化及摇床吸附等方式，对肠道菌群进行富集，从结果上来看，相对于未经树脂处理及单一树脂处理的样本，在单位菌量上均有大幅度的提升，同时活性上也有一定的升高，此外在色泽及气味的感官评价中也具有较好的表现水平，兼顾了纯化吸附及除色除味的效果。29、使用多种类型的吸附树脂，其吸附性能来源于大孔网状结构、连续聚合物相、连续孔相、高表面积和表面芳香性，具有优异的物理、化学和热稳定性，在ph为0-14之间均能稳定存在，适应温度在-20℃-150℃，孔隙度在1.0-2.5cc/g，表面积在200-700m2/g之间，含水量范围为20％-80％，并且在溶剂和水介质之间具有低溶胀性，产品标准属于食品级，生产成本低且能够进行再生处理后重新投入使用，树脂间的差别在于不同的孔隙率，这也是联合使用时能够提高除杂效率、提升菌群单位菌量、纯度、活性及除色除味的关键所在。30、本发明对人体粪便中食物残渣以及代谢产物进行高效的吸附，能够去除大部分异味，减轻色泽，避免患者在接收fmt治疗时产生心理障碍，同时提升菌群中的单位菌量、纯度及活性，实现用更少的剂量达到更好的治疗效果，提升fmt前端处理效率，此外在前面研究过程中，该发明对动物粪便样本进行肠道微生物提纯除杂方面也能够起到良好的作用。当前第1页12当前第1页12