用于凝血酶-抗凝血酶复合物（TAT）检测的清洗液及其制备方法与流程

本技术涉生物分析，具体来说，涉及一种用于凝血酶-抗凝血酶复合物(tat)检测的清洗液及其制备方法。

背景技术：

1、体内凝血酶形成后，凝血酶在血液中半衰期仅数秒，直接测定很困难，凝血酶部分迅速与抗凝血酶(antithrombin,at)结合形成凝血酶-抗凝血酶复合物(thrombin-antithrombin complex,tat)，该指标是反映凝血酶生成的分子标志物，可灵敏地反映凝血系统的激活程度，直接反映凝血系统启动。tat升高可早期预测血栓形成和复发风险、早期预测dic风险。

2、目前检测tat的方法主要是磁微粒化学发光检测，检测流程包括:上样、孵育、清洗、显色激发、判读，清洗步骤需要2-3次，且清洗液的成本会对微量的tat复合物产品复合物解离，因此清洗步骤对检测结果的准确性起到相当重要的作用，使用清洗液清洗的作用是去除非目标见检测物、终止磁微粒继续捕获检测目标物以及降低非靶标物质对测试结果的影响。清洗液不仅可以为检测反应中抗原抗体结果提供合适的缓冲体系环境,更重要的是减少其他干扰物质对后续检测反应产生影响,结束抗原抗体的继续结合,清洗液中的表面活性成分,可有效分离结合的免疫反应物及非特异性干扰物质,保证磁微粒化学发光检测反应能起到正常检测的作用。

3、再者,磁微粒化学发光检测设备中管道、进样针重复利用,会导致检测产生交叉污染,进而影响检测数据的稳定性。因此合适的化学发光清洗液对磁微粒化学发光检测设备的管路、进样针的维护以及保证样本测试准确具有重要意义。

4、而对于某些特殊的检测靶标对清洗液的要求可能会更高，尤其是某些对缓冲体系敏感的活性物质，如果清洗液缓冲成分不适合，会直接导致待检测目标物的降解或变性，最终导致检测试剂检测结果的准确性和稳定性降低。

5、申请号为201810130445x，专利名称为化学发光免疫分析用清洗液及磁微粒化学发光免疫分析检测方法的发明专利公开了一种化学发光免疫分析用清洗液，包括表面活性剂、非蛋白类蛋白保护剂和缓冲剂，所述表面活性剂包括阴离子表面活性剂、聚氧乙烯醚型非离子表面活性剂和酰胺型非离子表面活性剂，所述阴离子表面活性剂的分子式为r1-so3-m，其中r1为碳原子数为10～15的烷基，m为碱金属中的一种。可以保证测试试剂的测试的重复性、特异性，而且可以提高测试试剂的灵敏度。

6、申请号为2017104520526，专利名称为清洗液的发明专利公开了一种化学发光免疫分析用清洗液，包括磷酸缓冲体系、无机盐、表面活性剂a、表面活性剂b，以及防腐剂，所述磷酸缓冲体系为k2hpo4-kh2po4体系或na2hpo4.12h2o-kh2po4体系的一种，所述无机盐为nacl或kcl的一种或两种，所述表面活性剂a为tween-20或tritonx-100的一种，所述表面活性剂b为胆酸钠，所述防腐剂为proclin300或proclin950的一种或两种，所述清洗液中磷酸缓冲体系浓度以磷酸根计为0.1mol/l-0.5mol/l，所述清洗液中无机盐含量为90g/l-225g/l，所述清洗液中表面活性剂a体积百分比为1％-2.5％，所述清洗液中表面活性剂b含量为5g/l-25g/l，所述清洗液中防腐剂体积百分比为0.5％-3％，所述清洗液ph值为7.5-8.0。该清洗液各系统通用、稳定性好、有效期远高于市售清洗液、准确度高、精密度高且成本低廉。

7、但是上述对比文件均未公开清洗液如何减少抗原抗体的继续结合,减少非特异性干扰物质,减少待检测目标物的降解或变性从而提高检测结果的准确性和稳定性的技术方案。

8、申请内容

9、解决的技术问题

10、针对现有技术的不足，本技术提供了用于凝血酶-抗凝血酶复合物(tat)检测的清洗液及其制备方法，可以减少非特异性干扰物质,减少待检测目标物的降解或变性，从而提高检测结果的准确性和稳定性。

11、技术方案

12、为解决上述技术问题，本技术采用的具体技术方案如下：

13、一种用于凝血酶-抗凝血酶复合物(tat)检测的清洗液，包括：无机盐、金属离子、缓冲剂、针对性复合物稳定剂、单体稳定剂、表面活性剂和消泡剂。

14、本清洗液中针对性复合物稳定剂可以提高血浆中凝血酶-抗凝血酶复合物(tat)的稳定性，不易随着清洗的进行发生复合物的解离，结合其他盐离子、表面活性剂和糖类成分也可以降低单体形成新复合物的可能，经过大量实现证明表面活性剂与针对性复合物稳定剂联合使用,使得tat复合物稳定性更好，消泡剂可以减少在添加清洗液或洗涤过程中产生气泡,从而减少跳值现象的发生,提高检测精确度和精密性，因此本清洗液可以减少非特异性干扰物质,减少待检测目标物的降解或变性，从而提高检测结果的准确性和稳定性。

15、优选的，所述金属离子由所述无机盐提供，无机盐可以为氯化钠或氯化钾，钠离子或钾离子由氯化钠或氯化钾提供，金属离子的浓度为100-500mm，无机盐和金属离子起到提供维持蛋白质表面结构的功能，可以使清洗液具有一定的离子强度，从而使抗体能够特性地发挥结合作用，同时也可以使凝血酶-抗凝血酶复合物(tat)稳定存在。

16、优选的，所述缓冲剂的ph值为7.0-7.5，缓冲液的浓度为10-100mm，缓冲剂采用tris缓冲液，缓冲剂可以使蛋白质能够稳定长期保存，使用前采用固体酸调节剂调节缓冲剂的ph值至7.0-7.5，在该缓冲体系范围内，可以很好稳定tat和诊断抗体的活性，使检测结果更加稳定可靠。

17、优选的，所述针对性复合物稳定剂为甘露醇、海藻糖、精氨酸中的至少一种，针对性复合物稳定剂的浓度为0.1％-0.5％w/v，针对性复合物稳定剂起到稳定复合物的作用，且可以减少清洗导致的复合物解离的现象。

18、优选的，所述单体稳定剂为还原型谷胱甘肽、ddt、甘氨酸、尼泊金丙酷中的至少一种，单体稳定剂可以减少复合物在清洗过程中出现单体形成复合物，单体稳定剂的浓度为1-50mmol/l，大量实验证明单体稳定剂的浓度对于减少复合物在清洗过程中出现单体形成复合物的作用十分关键，当低浓度的一种或多种相关试剂时是可以稳定蛋白表面电荷或二硫键的，但是高浓度时会导致蛋白变性或使二硫键打开，所以合适的浓度和配比可以避免单体形成复合物的可能，也能维持复合物的存在形态。

19、优选的，所述表面活性剂为非离子型表面活性剂和两性表面活性剂联合使用，非离子型表面活性剂可以包括但不限于以下种类：tritonx-100、吐温20、吐温80、十二烷基硫酸钠、brij-35、月硅酸钠，两性表面活性剂可以包括但不限于以下种类：chaps，表面活性剂总浓度为0.02％-0.15％w/v，表面活性剂可有效清除免疫反应过程中的非特异性吸附物质,通过大量实验验证,采用非离子型表面活性剂和两性表面活性剂联合使用,可达到最佳洗涤效果,去除非特异性吸附物质的同时不破坏蛋白的特异性结合，同时也可以减少凝血酶单体和抗凝血酶复合物单体之间形成稳定复合物，最终使检测结果更加可靠准确。

20、优选的，所述清洗液还包括防腐剂，防腐剂为proclin300和/或bronidox，防腐剂浓度为0.02％-1.2％w/v，通过对防腐剂浓度的进一步筛选和限定,检测洗液空白来评价洗液抑菌效果，如果洗液抑菌效果差,出现染菌现象,则会导致洗液空白发光值上升,发光值上升越高说明染菌越严重,并且出现跳值现象,经实验验证,本发明清洗液在37度放置6个月,仍能保持洗液空白cv在5％以内,且较37度6个月发光值变化最小,说明洗液抑菌效果最好。

21、优选的，所述消泡剂为硅油型和/或硅醚型消泡剂，消泡剂浓度为0.03％-0.5％w/v，加入消泡剂的清洗液在tat项目上cv更小且信噪比更高，说明在清洗液中加入消泡剂后,能够清除或抑制气泡的产生,使反应体系混合清洗更加充分，有效减少检测过程中跳值现象的发生,提高试剂检测的精密性和准确性。

22、所述清洗液的ph值为7.1-7.5，经过大量实验证明，清洗液的ph值为7.1-7.5之间能够为整个反应体系提供适宜的酸碱环境，可以使磁球上的抗体捕获tat蛋白不脱落，且较好地维持磁球-抗体-复合物tat蛋白三聚体的结构。

23、一种用于凝血酶-抗凝血酶复合物(tat)检测的清洗液的制备方法，包括以下步骤：

24、步骤一：将无机盐、金属离子、缓冲剂和表面活性剂混合均匀再加入消泡剂；

25、步骤二：将步骤一得到的混合液中依次加入针对性复合物稳定剂和单体稳定剂混合均匀得到清洗液。

26、有益效果

27、与现有技术相比，本技术提供了用于凝血酶-抗凝血酶复合物(tat)检测的清洗液以及秸秆发酵方法，具备以下有益效果：

28、1、本清洗液中针对性复合物稳定剂可以提高血浆中凝血酶-抗凝血酶复合物(tat)的稳定性，不易随着清洗的进行发生复合物的解离，结合其他盐离子、表面活性剂和糖类成分也可以降低单体形成新复合物的可能，经过大量实现证明表面活性剂与针对性复合物稳定剂联合使用,使得tat复合物稳定性更好，消泡剂可以减少在添加清洗液或洗涤过程中产生气泡,从而减少跳值现象的发生,提高检测精确度和精密性，因此本清洗液可以减少非特异性干扰物质,减少待检测目标物的降解或变性，从而提高检测结果的准确性和稳定性；

29、2、本技术清洗液的金属离子可以由无机盐提供，也可以由其他含有金属离子的成分添加，无机盐可以为氯化钠或氯化钾，钠离子或钾离子由氯化钠或氯化钾提供，金属离子的浓度为100-500mm，无机盐和金属离子起到提供维持蛋白质表面结构的功能，可以使清洗液具有一定的离子强度，从而使抗体能够特性地发挥结合作用，同时也可以使凝血酶-抗凝血酶复合物(tat)稳定存在；

30、3、本技术清洗液的单体稳定剂的浓度为1-50mmol/l，大量实验证明单体稳定剂的浓度对于减少复合物在清洗过程中出现单体形成复合物的作用十分关键；

31、4、本技术清洗液的表面活性剂为非离子型表面活性剂和两性表面活性剂联合使用，表面活性剂浓度为0.02％-0.15％w/v，表面活性剂可有效清除免疫反应过程中的非特异性吸附物质,通过大量实验验证,采用非离子型表面活性剂和两性表面活性剂联合使用,可达到最佳洗涤效果,去除非特异性吸附物质的同时不破坏蛋白的特异性结合，同时也可以减少凝血酶单体和抗凝血酶复合物单体之间形成稳定复合物，最终使检测结果更加可靠准确；

32、5、本技术的清洗液的防腐剂为proclin300和/或尼泊金丙酷，防腐剂浓度为0.02％-1.2％w/v，本清洗液在37度放置6个月,仍能保持洗液空白cv在5％以内,且较37度6个月发光值变化最小,说明洗液抑菌效果最好；

33、6、本技术的清洗液的消泡剂为硅油型和/或硅醚型消泡剂，消泡剂浓度为0.03％-0.5％w/v，加入消泡剂的清洗液在tat项目上cv更小且信噪比更高，说明在清洗液中加入消泡剂后,清除或抑制气泡的产生,有效减少检测过程中跳值现象的发生,提高试剂检测的精密性和准确性；

34、7、本技术的清洗液的ph值为7.1-7.5，经过大量实验证明，清洗液的ph值为7.1-7.5之间能够为整个反应体系提供适宜的酸碱环境。

技术实现思路