一种一氧化氮检测试剂和检测方法及其应用与流程

本发明涉及一氧化氮的检测试剂及其应用。

背景技术：

1、一氧化氮(no)是一种广泛存在于生物体内的信使分子和效应分子，也是一种活性氮(active nitrogen species，ans)。已经知道，一氧化氮在生理学、病理学和药理学等方面具有重要作用。近年来，国外一些研究表明，一氧化氮自由基在衰老记忆损伤作用中发挥重要作用。另一些学者在对阿尔茨海默病患者的脑皮层进行研究中发现，一氧化氮自由基具有重要生物功能，它是内皮细胞松弛因子(edrf)，能抑制血小板凝集，但又具有反应性强和细胞毒性的一面，对心血管既有保护作用又可能有损伤，这种双面性非常典型的体现在了心脑血管系统中。其中，心肌缺血再灌注损伤与一氧化氮自由基的关系引起了人们的广泛关注。人们不仅应用生理生化方法进行了研究分析，而且也用esr技术研究了缺血再灌注过程产生的一氧化氮自由基。大量研究表明，血管内皮功能障碍与高血压密切相关。一氧化氮自由基减少与高血压的病例形成和发展奠定了基础。另外，no还具有免疫调节功能、抗溃疡以及调节性功能等作用。

2、目前已经有多种测定no的方法，如化学发光法、分光光度法、荧光法等。

3、化学发光法被认为是测定no的标准方法。经典的测定no的化学发光法是根据no与臭氧(o3)反应生成激发态二氧化氮(no2*)，no2*在返回基态的过程中释放能量而发光。此方法灵敏度较高，检出限为5pmol/l。但此方法的缺点是：no与o3的反应必须在气态进行，溶液中的一氧化氮必须用惰性气体将其气提出来，操作复杂，且该反应还存在易受氨气、硫化氢、烯类、二甲亚砜(dmso)等的干扰，以及反应条件不容易控制等。后来对氧化剂进行改进，用过氧化氢代替臭氧，即鲁米诺法。no可被h2o2强烈的氧化生成onoo-，而onoo-可使鲁米诺氧化并在溶液中发出很强的光。因为只有no可以激发这一光化学反应，而no2-和no3-则不能，所以该方法是可对溶液中的no进行实时测定且检测灵敏度最高的方法，其检出限可达10-13mol/l。由于人体血液中no极易被氧化为no2-甚至no3-，因此本法不适用于血液样本检测。

4、荧光法测定no的原理是no2-在酸性条件下与dan(2,3-diaminonaphthalene)发生反应，生成荧光物质1-(h)-naphthotriazole，该物质在碱性条件下(ph10以上)具有很高的荧光效率，用365nm光激发，在450nm处测定荧光强度进行定量测定。该法虽然具有较高灵敏度，但检测需要特殊仪器，且耗时较长，不适用于临床大规模筛查。

5、电化学检测和no微传感器虽然可以实时在体原位检测，但设备昂贵，临床应用并不广泛。

6、no在体内或水溶液中极易氧化生成no2-，在酸性条件下，no2-促使griess反应发生而生成重氮化合物。其浓度与no2-浓度具有线性关系。该化合物可在540～560nm处进行定量测定，即分光光度法，但此法操作过程中需要离心，处理量不易放大，过程费时费力且操作步骤繁琐大规模临床应用受到局限。

7、综上，急需操作简单，可以大规模临床应用的检测方法。

技术实现思路

1、针对现有技术中no检测方法操作复杂，不适合于大规模临床应用的技术问题，本发明提供一种一氧化氮检测试剂。

2、本发明的检测试剂依据酶循环的方法，利用酶的底物特异性来放大靶物质(被测物)，以提高测定准确度和简化检测步骤。

3、酶循环法是利用酶的底物特异性来放大靶物质(被测物)的测定方法，过程中持续消耗某一种反应物，被测物消耗后又循环产生，反应每循环一次，将消耗对应物质的量的某反应物和被测物，生成对应物质的量的被测物，因此，在一定时间内，反应循环的次数则相当于一次循环中反应物消耗的倍数，因此可以利用测定反应物消耗速率来测定靶物质的含量。此法仅循环靶物质，减少了样品中存在的其它物质对测定的干扰，因此不需要对样品进行预处理或对靶物质的提取，而且该法不需要专门的设备，是一种前景广阔的测定技术。由于酶法测定的特异性好，检测简便很多，反应温和，无污染，且灵敏度较高(10-6mol/l)，可满足体液中大部分物质的测定，因此在临床化学测定中已广为应用。

4、本发明提供了一种新的测定体液样本中一氧化氮的酶循环方法，该方法操作非常简便，具有优良的反应灵敏度。并首次采用测定一氧化氮方法中的工具酶，硝酸还原酶和亚硝酸盐歧化酶以及一氧化氮双加氧酶用于酶循环增量测定。此外，本发明同时还首次公开了基于上述三种工具酶的酶循环方法及利用该方法制备的一氧化氮诊断试剂，该试剂可以应用于目前广泛使用的临床自动分析仪，从而满足大规模筛查的要求。

5、本发明提供一种一氧化氮检测试剂，所述检测试剂包含还原型辅酶和/或其衍生物、硝酸还原酶、亚硝酸盐歧化酶和一氧化氮双加氧酶。

6、优选地，其包含：

7、硝酸还原酶，在还原型辅酶和/或其衍生物存在下，使样品中硝酸根离子发生还原反应生成亚硝酸根离子；

8、亚硝酸盐歧化酶，在h+存在条件下，能使上述反应生成的以及样品中的亚硝酸根发生反应生成一氧化氮和硝酸根离子；

9、一氧化氮双加氧酶，在氧气和还原型辅酶和/或其衍生物存在条件下，可使所述一氧化氮发生反应生成硝酸根离子。

10、优选地，所述还原型辅酶选自还原型辅酶i(nadh)或还原型辅酶ii(nadph)中的一种或两种；

11、优选地，所述还原型辅酶衍生物选自硫代还原型辅酶i(thio-nadh)或硫代还原型辅酶ii(thio-nadph)中的一种或两种。

12、优选地，所述一氧化氮双加氧酶能使所述一氧化氮在还原型辅酶和/或其衍生物和氧气的存在下发生反应生成硝酸根离子。

13、优选地，所述硝酸还原酶在还原型辅酶和/或其衍生物存在条件下，使待测样品中硝酸根离子发生如下式(1)所示反应：

14、

15、优选地，所述亚硝酸盐歧化酶与所述亚硝酸根离子发生如下式(2)所示反应：

16、

17、优选地，所述一氧化氮双加氧酶、一氧化氮和还原型辅酶和/或其衍生物发生如下式(3)所示反应：

18、

19、在反应过程中，还原型辅酶和/或其衍生物提供上述式(1)和式(3)反应所需的氢原子和电子。

20、优选地，所述检测试剂还包含缓冲液；

21、优选地，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。

22、优选地，所述检测试剂包含试剂r1和试剂r2，

23、其中，试剂r1包含：a.还原型辅酶溶液，或，b.含有还原型辅酶的缓冲液，

24、试剂r2包含硝酸还原酶、亚硝酸盐歧化酶和一氧化氮双加氧酶。

25、优选地，所述试剂r1中的还原型辅酶的质量百分比为0.01-0.05％，优选为0.02-0.03％，更优选为0.025％。

26、优选地，所述试剂r1中的缓冲液为tris-hcl缓冲液、hepes缓冲液、磷酸缓冲液中的一种或两种以上的组合，优选为磷酸缓冲液。

27、优选地，所述试剂r1中还含有表面活性剂和第一防腐剂；

28、优选地，所述表面活性剂选自吐温-20，brij 35，triton x-100中的一种或两种以上的组合，优选地，所述试剂r1中的表面活性剂的质量百分比为0.01-1％，优选为0.01-0.5％，更优选为0.1％；

29、优选地，所述第一防腐剂选自pc300，叠氮钠，庆大霉素，硫柳汞中的一种或两种以上的组合，优选地，所述试剂r1中的第一防腐剂的质量百分比为0.01-0.5％，优选为0.01-0.2％，更优选为0.1％。

30、优选地，所述试剂r2中硝酸还原酶的含量为1-9ku/l，优选为3-5ku/l；

31、优选地，所述试剂r2中亚硝酸盐歧化酶的含量为3-11ku/l，优选为5-7ku/l；

32、优选地，所述试剂r2中一氧化氮双加氧酶的含量为2-10ku/l，优选为4-6ku/l。

33、优选地，所述试剂r2中还含有第二缓冲液、甘露糖醇、金属离子或第二防腐剂中的一种或两种以上的组合；

34、优选地，所述第二缓冲液选自磷酸盐缓冲液、tris-hcl缓冲液、hepes缓冲液中的一种；

35、优选地，所述试剂r2中的甘露糖醇的质量百分比为0.01-5％，优选为0.01-1％，更优选为0.1％；

36、优选地，所述金属离子选自fe2+、mg2+、ca2+中的一种或两种以上的组合；优选地，所述试剂r2中的金属离子的摩尔浓度为0.1-10mm，优选为1-5mm；

37、优选地，所述第二防腐剂选自pc300，叠氮钠，庆大霉素，硫柳汞中的一种或两种以上的组合，优选地，所述试剂r2中的第二防腐剂的质量百分比为0.01-0.5％，优选为0.01-0.2％，更优选为0.1％。

38、优选地，所述检测试剂中还含有校准品，校准品为硝酸钠水溶液，浓度点为0,12.5,25,50,100,200μmol/l。

39、本发明还提供一种一氧化氮检测试剂盒，其包含：

40、含有硝酸还原酶和还原型辅酶和/或其衍生物的单元，能使待测样品中硝酸根离子发生还原反应生成亚硝酸根离子；

41、含有亚硝酸盐歧化酶的单元，能使所述亚硝酸根离子发生反应生成一氧化氮和硝酸根离子；

42、含有一氧化氮双加氧酶和还原型辅酶和/或其衍生物的单元，能使所述一氧化氮在还原型辅酶和/或其衍生物的存在下发生反应生成硝酸根离子。

43、本发明还提供一种一氧化氮含量的检测方法，所述检测方法中包含如下酶循环反应：

44、

45、优选地，利用包含所述的检测试剂对样本进行检测。

46、优选地，检测还原型辅酶消耗速率，得到样本中一氧化氮含量；

47、优选地，利用分光光度法检测还原型辅酶消耗速率。

48、优选地，所述检测方法包含如下步骤：将样本与还原型辅酶混合，加入硝酸还原酶、亚硝酸盐歧化酶和一氧化氮双加氧酶，检测还原型辅酶消耗速率，得到样本中的一氧化氮的含量；

49、优选地，将样本与含有还原型辅酶的缓冲液混合，加入硝酸还原酶、亚硝酸盐歧化酶和一氧化氮双加氧酶，检测还原型辅酶消耗速率，得到样本中的一氧化氮的含量。

50、优选地，利用速率法或终点法计算样本中的一氧化氮的含量，优选为速率法。

51、优选地，所述样本为细胞裂解液、组织裂解液、组织或细胞培养液、血清、血浆、尿液、水溶液。

52、优选地，所述的检测方法包含将试剂r1与待测样本混合，然后加入试剂r2进行检测；

53、优选地，试剂r1、试剂r2、待测样本的体积比为200-300∶30-100∶1-20，优选为200∶60∶10。

54、优选地，所述的检测方法还包含将试剂r1与校准品混合，然后加入试剂r2进行检测，制作标准曲线。

55、本发明还提供所述的检测试剂或所述的检测方法在检测一氧化氮含量中的应用。

56、本发明提供了一种采用循环增量技术的酶学测定方法及其试剂，测定体液样本中一氧化氮的含量。该循环增量测定系统主要由硝酸还原酶、亚硝酸盐歧化酶和一氧化氮双加氧酶组成。硝酸还原酶目前已广泛应用于griess试剂；亚硝酸盐歧化酶和一氧化氮双加氧酶在酶循环体系中应用较为少见。

57、本发明提供了一种测定一氧化氮的诊断试剂，包含硝酸还原酶、亚硝酸盐歧化酶和一氧化氮双加氧酶，除了以上三种工具酶，还包含还原型辅酶和/或其衍生物，因为实际上还原型辅酶的衍生物可以通过一些反应生成还原型辅酶i/ii，从而发生消耗还原型辅酶i/ii的酶循环反应。

58、一氧化氮在体内或水溶液中通常被氧化为硝酸盐或亚硝酸盐，硝酸盐被诊断试剂中的硝酸还原酶(ec 1.7.1.1)(ec号是酶学委员会(enzyme commission)为酶所制作的一套编号分类法，是以每种酶所催化的化学反应为分类基础。这套分类法亦同时会为各种酶给予一个建议的名称，所以亦称为酶学委员会命名法。)还原成亚硝酸盐，同时消耗还原型辅酶i/ii，然后，在亚硝酸盐歧化酶(ec 1.7.6.1)的催化作用下，生成一氧化氮和硝酸盐。一氧化氮在一氧化氮双加氧酶(ec 1.14.12.17)的作用下氧化为硝酸盐/亚硝酸盐，同时消耗还原型辅酶i/ii。因此，样本中的硝酸盐反复循环反应，不断消耗还原型辅酶i/ii，还原型辅酶i/ii的消耗速率与样本中硝酸盐/亚硝酸盐的含量成正比，通过测定还原型辅酶i/ii的消耗速率就可以达到测定体液样本中一氧化氮含量的目的。

59、本发明提供了一种一氧化氮测定方法，各步骤主要发生的化学反应方程式如下所示：

60、

61、一氧化氮在体内或水溶液中极易氧化生成亚硝酸盐或者硝酸盐，因此需要先将溶液中的硝酸盐用硝酸还原酶还原为亚硝酸盐，进而采用亚硝酸盐歧化酶和一氧化氮双加氧酶进行后两步酶循环反应。

62、本发明首次创建了由硝酸还原酶、亚硝酸盐歧化酶和一氧化氮双加氧酶组成的酶循环反应，并应用于一氧化氮的测定。基于酶法循环增量测定的特点，循环反应系统的酶使用量不要求很高。当然，增加酶的用量并不影响本发明方法的应用，但会增加试剂的制造成本。优化酶和底物应用量可以促进循环反应向理想的方向进行，参考化学反应方程式(1)和(3)即可。

63、本发明提供的一氧化氮检测试剂应用于一氧化氮检测，操作方法简便，具有优良的反应灵敏度，具有方便、快捷、自动化、抗干扰强和高灵敏度的特点。该试剂可以应用于目前广泛使用的临床自动分析仪，从而满足大规模筛查的要求。本发明提供了一种新的测定体液样本中一氧化氮的酶循环方法，该方法首次采用测定一氧化氮方法中的工具酶，硝酸还原酶和亚硝酸盐歧化酶以及一氧化氮双加氧酶用于酶循环增量测定。

64、本发明提供的检测试剂检测通量大，单位时间内检测量多，能够大规模应用于一氧化氮检测。