一种疟原虫种属鉴定和分型的引物和检测方法

本发明属于分子生物学检测，涉及一种病原体的检测方法，特别涉及一种疟原虫种属鉴定和分型的引物和检测方法。

背景技术：

0、技术背景

1、疟疾是由疟原虫感染引起的严重危害人类健康的重要传染病。2021年全球报告2.47亿例疟疾病例、死亡病例61.9万。我国目前已通过消除疟疾认证，但仍然存在由境外输入性疟疾病例引起的再传播风险，对基层医疗机构疟疾检测试剂的储备和检测人员能力的维持提出挑战。对于疟原虫感染病例，不同虫种可引起不同疟疾症状，对抗疟药物可能产生耐药性情况不一。因此，检测疟原虫属病原体并鉴别具体虫种，对疟疾的临床治疗、现场防治和监测预警至关重要。

2、目前，检测疟原虫感染、进行虫种鉴别的常用方法主要包括外周血涂片染色镜检法、酶联免疫吸附法、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，pcr)、实时荧光pcr法(quantitative real-time pcr，qpcr)等，然而，这些方法受限于花费大、检测周期长、需要专业技术人员和庞大设备支持等缺点。作为发展迅速分子诊断技术，基于规律成簇的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，crispr)/crispr相关(crispr-associated，cas)系统具有强特异性和可编程性，易与现场即时检测设备相结合，已在核酸检测领域展现出巨大潜力。为提高基于crispr检测方法的灵敏度，其与等温扩增方法如重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymeraseamplification，rpa)结合后，可实现单分子检测。因此，应用rpa-crispr系统检测疟原虫属、鉴别疟原虫种，提供了一种快速(检测时间1小时)、方便(37℃等温反应)、简便(易与现场即使检测设备结合)的方法，具有重要意义。

3、微流控芯片技术可集成不同检测操作单元，由微管道联系整个系统。由于其在生物、化学、医学等领域展现处的潜力，微流控芯片技术已发展成多学科交叉的崭新研究领域。搭载多个反应腔室，实现高通量检测的微流控芯片简化了实验操作，有利于现场防治，大大提升现场即时筛查的能力。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种特异性强、灵敏度高的用于疟原虫种属同检的一种疟原虫种属鉴定和分型的引物和检测方法。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

3、一种疟原虫种属鉴定的引物，检测疟原虫专用等温扩增引物为一组rpa扩增引物，碱基序列依次为seq id no.1-2所示。

4、一种所述的引物的应用，所述引物在疟原虫种属鉴定中的应用。

5、一种疟原虫种属分型的crrna，用于鉴别疟原虫属分型的特异性crrna，碱基序列依次为seq id no.3-seq id no.8所示。

6、一种所述的疟原虫种属分型的crrna的应用，所述crrna在鉴别疟原虫种属分型中的应用。

7、一种疟原虫种属鉴定和分型的引物，引物为所述的鉴定疟原虫的rpa专用引物和所述的疟原虫种属分型的crrna。

8、一种所述的疟原虫种属鉴定和分型的引物的应用，所述引物在疟原虫种属鉴定和分型中的应用。

9、上述疟原虫种属鉴定，是指能准确将疟原虫属寄生虫鉴定出；虫种属分型，是指能准确将疟原虫区分恶性疟原虫(p.falciparum)、诺氏疟原虫(p.knowlesi)、三日疟原虫(p.malariae)、卵形疟原虫(p.ovale)、间日疟原虫(p.vivax)的疟原虫分型。

10、上述用于疟原虫属检测和虫种鉴别的专用引物，是选取疟原虫18srrna虫属保守区及种间变异区的基因或区域作为rpa扩增靶标及crispr/cas12a检测靶标，并筛选包含crispr/cas12a检测所需原型间区序列邻近基序(protospacer adjacent motif，pam)位点的靶标序列设计crrna。选取虫属保守区设计rpa扩增引物；选取虫属保守区设计一条crrna；选取能准确将疟原虫分成p.falciparum、p.knowlesi、p.malariae、p.ovale和p.vivax等5种疟原虫虫种的相关种间变异区域分别设计5条特异性crrna。

11、上述疟原虫种属鉴定和分型专用rpa引物和crrna，所述专用rpa引物共一组，为seq id no.1-2两条引物组成，一条为正向引物，一条为反向引物，用于rpa扩增反应。所述crrna共六条，其中seq id no.3一条靶向虫属保守区序列，seq id no.4-8分别靶向p.falciparum、p.knowlesi、p.malariae、p.ovale和p.vivax虫种的相关变异区域。引物序列信息见表1。

12、表1引物及crrna序列信息

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15、一种用于检测疟原虫和虫种分型的微流控芯片检测平台，含seq id no.1-2所示用于检测疟原虫的rpa引物，以及seq id no.3-seq id no.8所示检测疟原虫属及虫种分型的crrna。

16、所述检测平台为微流控芯片；其中，微流控芯片的中心设有中心进样口，中心进样口外围的微流控芯片上沿圆周方向均匀设有多个反应腔，每个反应腔室分别通过毛细管通道与中心进样口相连。

17、其中，微流控芯片的构建为：微流控芯片经solidworks 2021软件设计，芯片横截面直径26mm，高7.2mm，四周反应腔室参数为2.1mm*3mm*3.8mm，中心进样口半径3.4mm，高4.5mm。将设计稿保存为.stl格式后，用3d打印机(formlabstm，form 3)打印成型，使用材料为透明树脂(formlabstm，flgpcl04)。

18、一种基于pcr管检测疟原虫和虫种鉴别的方法：

19、(1)使用商品化dna提取试剂盒完成测试样本核酸的提取；

20、(2)以待测样本的核酸为模板，在利用所述引物的引导下配制rpa扩增反应体系，进行各检测反应孔特异性扩增；

21、其中，rpa体系的构建为：rpa试剂盒购自英国twistdx公司。一个rpa体系为50μl；往rpa干粉里加入25μl缓冲液、2μl正向引物rpa_f(10μm)、2μl反向引物rpa_r(10μm)、14.5μl h2o、2.5μl乙酸镁以及4μl的样本(实验组)/h2o(对照组)。

22、其中，反应条件为：金属浴模块中37℃恒温孵育20分钟。

23、(3)将10μl扩增产物加入分别包含特异性crrna的crispr/cas12a体系中；根据cas12a蛋白对荧光报告探针的切割，实验组反应前后荧光从无到有的变化，检测样本中疟原虫属有无，并鉴别具体虫种。

24、所述每个crispr/cas12a反应体系的构建为：由终浓度为200nm cas12a、200nmcrrna、800nm荧光报告探针、1x neb r2.1 buffer以及无核酶水共同配制合成终体积为10μl的反应体系；所述每个crispr/cas12a反应体系中荧光报告探针为fam-ttatt-bhq1。

25、进一步的说，在crispr/cas12a反应中，由于目标序列的序列特异性，仅能与其完全碱基互补配对的crrna结合，激活相应cas12a蛋白，根据cas12a蛋白对荧光报告探针的切割，实验组反应前后荧光从无到有的变化，在quantstudio 7flex real-time pcr system进行crispr/cas12a反应的条件为：37℃孵育10分钟完成反应，每30秒收集一次荧光信号。反应结束后使用quantstudio 6and 7flex real-time pcr software v1.0软件提取各组荧光强度数值，运用graphpad prism 8、powerpoint进行结果图的绘制。若荧光强度显著高于阴性对照组，则表明样本中存在该虫种。若样本种存在某具体虫种，应至少能引起两个crispr/cas12a反应输出荧光信号，分别是pan-crrna所在体系及该具体虫种所在体系。

26、一种基于微流控芯片检测疟原虫和虫种鉴别的方法：

27、(1)使用商品化dna提取试剂盒完成测试样本核酸的提取；

28、(2)以待测样本的核酸为模板，在利用所述引物的引导下配制rpa扩增反应体系；

29、其中，rpa体系的构建为：rpa试剂盒购自英国twistdx公司。一个rpa体系为50μl；往rpa干粉里加入25μl缓冲液、2μl正向引物rpa_f(10μm)、2μl反向引物rpa_r(10μm)、14.5μl h2o、2.5μl乙酸镁以及4μl的样本。

30、(3)将配好的90μlrpa反应体系自微流控芯片中心进样口加入，分别流入包含六种特异性crrna的crispr/cas12a体系中；根据cas12a蛋白对荧光报告探针的切割，实验组反应前后荧光从无到有的变化，检测样本中疟原虫属有无，并鉴别具体虫种。

31、所述每个crispr/cas12a反应体系的构建为：由终浓度为200nm cas12a、200nmcrrna、800nm荧光报告探针、1x neb r2.1 buffer以及无核酶水共同配制合成终体积为10μl的反应体系；所述每个crispr/cas12a反应体系中荧光报告探针为fam-ttatt-bhq1。

32、进一步的说，在crispr/cas12a反应中，由于目标序列的序列特异性，仅能与其完全碱基互补配对的crrna结合，激活相应cas12a蛋白，根据cas12a蛋白对荧光报告探针的切割，实验组反应前后荧光从无到有的变化，在金属浴进行反应的条件为：37℃孵育60分钟完成反应。反应结束后在蓝光灯照射下经滤光片观察各反应腔室荧光信号情况。若样本为阳性，则在包含疟原虫属crrna的反应腔室可观察到荧光信号；根据p.falciparum、p.knowlesi、p.malariae、p.ovale和p.vivax虫种特异性crrna的反应腔室荧光信号有无，判断样本中所含虫种的型别。

33、与现有技术相比，本发明的积极效果是：

34、首先，本方法利用rpa-crispr方法检测疟原虫感染、进行虫种鉴别，反应在恒温37℃条件下进行，没有复杂的温控需求；本方法反应时间方面，基于pcr管的分步反应时间为rpa 20分钟、crispr反应10分钟，共30分钟，而基于微流控芯片的一步法总反应时间为60分钟，实现快速检测；本方法设计的rpa专用引物，可通过一次反应扩增出同时包含虫属保守区和虫种变异区的靶标序列，后偶联crispr/cas12a反应体系，实现方便、特异检测；进一步，本方法将rpa-crispr反应集成至微流控芯片，实现一次加样六种反应的高通量检测，根据芯片上各反应腔室的荧光有无即可判断疟原虫属寄生虫是否存在、并鉴别虫种。因此本方法为开发疟原虫种属同检的检测方法及检测平台提供新的技术手段。