一种采用碳纳米管基因载体递送系统促进草鱼生长的方法

本发明属于水产生物，具体涉及一种采用碳纳米管基因载体递送系统促进草鱼生长的方法。

背景技术：

1、碳纳米管（carbon nanotubes，cnts）是一种无缝、中空的管状物质，由单层石墨片卷曲形成的为单壁碳纳米管（swcnts），由多层石墨片卷曲形成的即为多壁碳纳米管（mwcnts）。碳纳米管具有十分优越的性能，比如大的比表面积以及吸附性能，它们可以非共价和共价结合药物，生物分子以及纳米粒子，独特的管状结构或者说针状结构使其具有较高的穿透能力，可以轻松穿透细胞膜等结构，增强将多肽、蛋白质和核酸输送到细胞内的能力，极大的比表面积有利于与更多的核酸结合，大大提高了负载量。很多研究显示碳纳米管经过功能化修饰后可以显著降低其生物毒性，使其具有更好的生物相容性。

2、碳纳米管本身不溶于水，在水中的分散性很差，但通过功能化修饰、超声波等化学、物理方法相结合可以大大提高碳纳米管在水中的分散性以及更好地连接基因载体。同时鱼类本身就拥有很大的粘膜表面（皮肤、鳃、肠道和鼻腔粘膜等），因此通过浸泡的方式向鱼体细胞递送质粒不仅大大缩短递送时间，也更容易实现大规模化，更经济适用。

3、草鱼（ ctenopharyngodon idella）是鲤形目，鲤科，雅罗鱼亚科，“四大家鱼”之一。草鱼是我国重要的经济鱼类，是淡水养殖产量最大的鱼类，提升草鱼品质，促进草鱼生长对于促进草鱼养殖业的可持续健康发展有着重要的意义。生长激素（growth hormone，gh）是包括鱼类在内的所有脊椎动物脑下垂体产生的一种单链多肽激素，在鱼类中，参与鱼的生长代谢，促进体细胞生长；另外，还具有调节渗透压、电解质平衡等与新陈代谢有关的功能，在鱼类水产养殖业上具有重大的作用。克隆编码生长激素的生长激素基因连接表达载体转入鱼体细胞进行过表达是促进鱼类生长的一个常用方法，传统的基因转运方法：细菌转化、病毒转染、显微注射等都存在一定的局限性，且不易实现规模化操作，而将功能化修饰后的碳纳米管作为基因转运载体具有携载率高、穿膜能力强、成本低、细胞毒性小等优点，因此，利用碳纳米管为载体携带草鱼生长激素基因过表达载体进入草鱼细胞具有很大的可行性来达到促生长的目的。

4、本发明拟借助碳纳米管这一载体向草鱼细胞递送基因载体，实现生长激素基因在鱼体内的过表达，促进草鱼的生长，形成一种基于碳纳米管基因载体递送系统促进草鱼生长的方法，并进一步将碳纳米管基因载体递送系统制备成能促进草鱼生长的产品。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种采用碳纳米管基因载体递送系统促进草鱼生长的方法。

2、本发明的目的还在于提供碳纳米管基因载体递送系统在制备促进草鱼生长产品中的应用。

3、本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种采用碳纳米管基因载体递送系统促进草鱼生长的方法，包括以下步骤：

4、（s1）构建草鱼生长激素基因重组质粒；

5、（s2）对碳纳米管进行功能化修饰；

6、（s3）用超声波将功能化修饰碳纳米管分散于水中，将功能化修饰碳纳米管与水体中草鱼生长激素基因重组质粒结合，得碳纳米管基因载体递送系统；

7、（s4）将碳纳米管基因载体递送系统溶于水中，将草鱼在碳纳米管基因载体递送系统水溶液中浸泡，通过浸泡的方式将碳纳米管基因载体递送系统进入草鱼细胞，使草鱼生长激素基因在草鱼细胞内进行过表达，从而促进草鱼的生长。

8、本发明方法首先构建草鱼生长激素基因重组质粒，对碳纳米管进行功能化修饰使其很好地连接过表达载体并增加在水中的分散性，用超声波将功能化修饰后的碳纳米管分散于水中，与水体中草鱼生长激素基因重组质粒结合，通过浸泡的方式碳纳米管携带重组质粒进入草鱼细胞，生长基因在细胞内进行过表达，从而促进草鱼的生长。

9、在该采用碳纳米管基因载体递送系统促进草鱼生长的方法中：

10、可选地，步骤（s1）中构建草鱼生长激素基因重组质粒包括：取草鱼垂体组织样品进行总rna的提取，反转录得到cdna，设计引物克隆得到目的基因草鱼gh基因，将pcdna4.0质粒双酶切后与目的基因草鱼gh基因进行连接得到目的基因重组质粒pcdna4.0-草鱼gh基因，其中所述引物包括上游引物gh-f和下游引物gh-r，所述上游引物gh-f的序列如seq idno：1所示，下游引物gh-r的序列如seq id no：2所示。

11、可选地，步骤（s2）中对碳纳米管进行功能化修饰包括：用浓硫酸与浓硝酸的混合酸将碳纳米管进行氧化，使其增加官能团羧基，随后与大分子物质聚乙烯亚胺pei进行氨化反应结合，所得产物经洗涤后冻干得到功能化修饰的碳纳米管。

12、可选地，所述浓硫酸与浓硝酸的体积比为2:1~4:1，更佳为3:1，氧化时间为45~50h，更佳为48 h，所述聚乙烯亚胺pei的分子量为900~1800 da，更佳为1800 da，氨化时间为70~75 h，更佳为72 h，所述碳纳米管为单壁碳纳米管，所述单壁碳纳米管的规格为：od值：1~2 nm；长度：1~3 μm；纯度：>90 %。

13、可选地，步骤（s3）中用超声波将功能化修饰碳纳米管分散于水中的时间为30~60min，更佳为40 min。

14、可选地，步骤（s3）中所述功能化修饰碳纳米管与草鱼生长激素基因重组质粒的质量份配比为2~8：1，更佳为6：1。

15、可选地，步骤（s4）中所述碳纳米管基因载体递送系统水溶液的浓度为1~10 mg/l，更佳为5 mg/l。

16、可选地，步骤（s4）中将草鱼在碳纳米管基因载体递送系统水溶液中浸泡6~12 h，更佳为8 h。

17、因此，作为本发明的一种优选的实施方式，本发明提供的一种采用碳纳米管基因载体递送系统促进草鱼生长的方法，包括以下步骤：

18、（s1）基因的克隆及重组：取草鱼垂体组织样品进行总rna的提取，反转录得到cdna，设计引物克隆得到目的基因，将质粒双酶切后与目的基因进行连接得到目的基因重组质粒，测序验证成功后扩培得到大量的重组质粒；

19、（s2）碳纳米管的功能化修饰：用浓硫酸与浓硝酸体积比为3：1的混合酸将碳纳米管进行氧化，使其增加官能团羧基（-cooh），随后进行氨化，与大分子物质聚乙烯亚胺（pei）反应结合，纯水洗涤之后冻干得到功能化修饰的碳纳米管，氨化后的碳纳米管在水中分散性提高，可以吸附质粒并携带其进入鱼体细胞；

20、（s3）碳纳米管与重组质粒的连接：将碳纳米管用超声波均匀分散在水中40 min，设置一系列碳纳米管与质粒不同质量比（2：1~8：1）进行连接，电泳跑琼脂糖凝胶来鉴定其连接效果，选择合适的质量比例6：1用于后续的实验；

21、（s4）浸泡处理：将生长激素基因重组质粒与功能化修饰后的单壁碳纳米管连接成功的产物稀释到水体至5 mg/l，使草鱼在该水体中浸泡8 h，碳纳米管浸泡之后转入正常水体饲养。

22、本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：碳纳米管基因载体递送系统在制备促进草鱼生长产品中的应用。

23、可选地，所述碳纳米管基因载体递送系统主要由功能化修饰碳纳米管和草鱼生长激素基因重组质粒结合而成，所述草鱼生长激素基因重组质粒为pcdna4.0-草鱼gh基因。

24、与现有技术相比，本发明具有以下优点：

25、（1）本发明提供了一种基因载体递送方式来实现生长基因在草鱼内的过表达，促进了草鱼的生长，为制备促进鱼类生长的产品提供了新思路；

26、（2）本发明利用功能化修饰后的碳纳米管携带草鱼生长激素基因重组质粒通过浸泡的方式进入草鱼细胞，对鱼体内基因进行调控；

27、（3）本发明通过浸泡的方式向鱼体细胞递送生长激素基因过表达载体可以实现大批量操作，有利于实现规模化，省时省力；

28、（4）本发明浸泡的方式会大大减少鱼体的伤害，减少实验对鱼带来的副作用，提高鱼苗的成活率；

29、（5）本发明碳纳米管基因载体递送手段适用于不同生长阶段的鱼体，可以在不同时期实现生长激素基因的过表达。