多酶级联合成(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇的方法及其应用

本发明属于生物催化和生物制药领域，具体涉及一种利用生物催化剂合成氟苯尼考手性中间体(1r,2r)-4-甲砜基苯丝氨醇的方法。

背景技术：

1、氟苯尼考，化学名称为d(+)-苏-1-对甲砜基苯基-2-二氯乙酰氨基-3-氟丙醇，结构式如下所示：

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3、氟苯尼考是在八十年代后期成功研制的一种新的兽医专用β-氨基醇类抗生素，1990年首次在日本上市，1993年挪威批准该药治疗鲑的疖病，1995年法国、英国、奥地利、墨西哥及西班牙批准用于治疗牛呼吸系统细菌性疾病。在日本和墨西哥还批准用作猪的饲料添加剂，预防和治疗猪的细菌性疾病。氟苯尼考因其具有更好的抗菌活性、安全性和有效性，不易产生耐药性，没有再生障碍性贫血、致畸、致癌和致突变等作用，是替代氯霉素和甲砜霉素的新一代氯霉素类抗生素。

4、(1r,2r)-4-甲砜基苯丝氨醇是合成氟苯尼考的关键手性砌块。目前化学法合成(1r,2r)-4-甲砜基苯丝氨醇，是以对甲砜基苯甲醛和甘氨酸为原料，经过铜盐催化、硫酸酯化、d-酒石酸手性拆分、硼氢化钾还原等多步反应，合成路线如下所示。

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6、上述化学法合成的反应过程繁琐，反应条件剧烈；生产过程产生大量的高盐和有机废水，严重污染环境；而且在硼氢化钾还原步骤还会产生氢气，存在安全生产问题。

7、因此建立(1r,2r)-4-甲砜基苯丝氨醇的高效绿色合成路线，具有广阔的应用前景，也是目前手性合成研究的难点。2021年，上海交通大学林双君教授课题组以对甲砜基苯甲醛与羟基丙酮酸锂为底物，利用转酮酶ectk1_yyh和转氨酶ata117_achh的催化合成(1r,2r)-1,3-二羟基-2-氨基-1-对甲砜基苯丙烷(one-pot asymmetric synthesis of anaminodiol intermediate of florfenicol using engineered transketolase andtransaminase，2021，acs catalysis；专利“一种利用酶级联反应合成(1r,2r)-ampp的方法”，cn202110162637.0)。但该方法羟基丙酮酸锂价格昂贵，成本高，反应转化率低。

8、综上所述，针对现有技术中所存在的相关问题，现在亟需研发出一种成本低、反应条件温和、立体选择性好、安全环保、高效绿色的氟苯尼考手性中间体(1r,2r)-4-甲砜基苯丝氨醇的生物合成方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供多酶级联合成氟苯尼考中间体(1r,2r)-4-甲砜基苯丝氨醇的方法，以解决现有技术中(1r,2r)-4-甲砜基苯丝氨醇合成所存在的反应过程繁琐，产生污染环境的副产物，成本高，反应转化率低等技术问题。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、在上述方案的基础上，在另一改进的方案中，以d-丝氨酸、对甲砜基苯甲醛和d-丙氨酸为底物，利用氨基酸氧化酶、丙酮酸脱羧酶和转氨酶为催化剂，通过多酶级联反应合成(1r,2r)-4-甲砜基苯丝氨醇；合成路线包括：d-丝氨酸首先被氨基酸氧化酶转化为β-羟基丙酮酸，β-羟基丙酮酸和对甲砜基苯甲醛在丙酮酸脱羧酶的催化下生成中间产物2a(化学名称为：(r)-1-对甲砜基苯基-1-羟基-2-氧代-3-丙醇)，中间产物2a和d-丙氨酸继续在转氨酶的催化下转化为(1r,2r)-4-甲砜基苯丝氨醇。

4、在上述方案的基础上，在另一改进的方案中，反应体系包括：100ml反应体系中含有50mm tris-hcl缓冲液，氨基酸氧化酶、丙酮酸脱羧酶、转氨酶的含酶湿菌体5g，120mm d-丝氨酸，20mm对甲砜基苯甲醛，120mm d-丙氨酸，2.5mm 5′-磷酸吡哆醇，2mm mgcl2，500u/ml过氧化氢酶，1mm硫胺素焦磷酸；反应条件为：所有原料混合后置于30℃下振荡反应14h。

5、在上述方案的基础上，在另一改进的方案中，所述氨基酸氧化酶、所述丙酮酸脱羧酶和所述转氨酶来自于采用基因工程手段共表达氨基酸氧化酶基因-丙酮酸脱羧酶基因-转氨酶基因的重组大肠杆菌全细胞，或者所述氨基酸氧化酶、所述丙酮酸脱羧酶和所述转氨酶来自于采用基因工程手段分别表达氨基酸氧化酶基因、丙酮酸脱羧酶基因、转氨酶基因的重组大肠杆菌全细胞。

6、在上述方案的基础上，在另一改进的方案中，所述氨基酸氧化酶包含seq id no：1所示的氨基酸序列或者与所述seq id no：1所示的氨基酸序列同源性高于80％的多肽蛋白；所述丙酮酸脱羧酶包含seq id no：3所示的氨基酸序列或者与所述seq id no：3所示的氨基酸序列同源性高于80％的多肽蛋白；所述转氨酶包含seq id no：5所示的氨基酸序列或者与所述seq id no：5所示的氨基酸序列同源性高于80％的多肽蛋白。

7、在上述方案的基础上，在另一改进的方案中，所述氨基酸氧化酶为rtdaao，编码所述rtdaao的基因序列如seq id no：2所示；所述丙酮酸脱羧酶为swpdc，编码所述swpdc的基因序列如seq id no：4所示；所述转氨酶为ceta，编码所述ceta的基因序列如seq id no：6所示。

8、在上述方案的基础上，在另一改进的方案中，100ml反应体系中，含5g氨基酸氧化酶基因-丙酮酸脱羧酶基因-转氨酶基因的共表达重组大肠杆菌全细胞、50mm tris-hcl缓冲液、120mm d-丝氨酸、20mm对甲砜基苯甲醛、120mm d-丙氨酸、2.5mm 5’-磷酸吡哆醇、2mmmgcl2、500u/ml过氧化氢酶、1mm硫胺素焦磷酸。

9、在上述方案的基础上，在另一改进的方案中，100ml反应体系中，含5g氨基酸氧化酶基因表达重组大肠杆菌全细胞、5g丙酮酸脱羧酶基因表达重组大肠杆菌全细胞、5g转氨酶基因表达重组大肠杆菌全细胞、50mm tris-hcl缓冲液，120mm d-丝氨酸、20mm对甲砜基苯甲醛、120mm d-丙氨酸、2.5mm 5’-磷酸吡哆醇、2mm mgcl2、500u/ml过氧化氢酶、1mm硫胺素焦磷酸。

10、在上述方案的基础上，在另一改进的方案中，所述合成(1r,2r)-4-甲砜基苯丝氨醇的反应结束后，使用乙酸乙酯淬灭反应，取上清液进行硅胶柱层析分离，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝5:3(v/v)。

11、本发明至少具有以下有益效果：

12、本技术在本领域首次提出直接使用d-丝氨酸、对甲砜基苯甲醛和d-丙氨酸作为底物，采用多酶级联反应“一锅法”高效合成(1r,2r)-4-甲砜基苯丝氨醇。该方法包括以下步骤：以d-丝氨酸、对甲砜基苯甲醛和d-丙氨酸为底物，利用氨基酸氧化酶、丙酮酸脱羧酶和转氨酶为催化剂，多酶级联合成氟苯尼考手性中间体(1r,2r)-4-甲砜基苯丝氨醇，合成路线如下所示：

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14、本发明提供一种利用多酶级联不对称合成氟苯尼考手性中间体(1r,2r)-4-甲砜基苯丝氨醇的方法。本技术的合成方法以廉价易得的d-丝氨酸、对甲砜基苯甲醛和d-丙氨酸为底物，通过氨基酸氧化酶、丙酮酸脱羧酶及转氨酶多酶级联反应，在常温常压下通过“一锅法”反应便可获得氟苯尼考的关键手性砌块(1r,2r)-4-甲砜基苯丝氨醇，目标产物的转化率为99.9％。本技术的(1r,2r)-4-甲砜基苯丝氨醇合成方法无需分离中间产物，具有成本低、反应条件温和、立体选择性好、安全环保等特点，为一种高效绿色生物合成途径。