靶向CLDN18.2的多肽、放射性核素标记靶向肽及其应用

本发明涉及多肽药物的筛选、放射性核素标记的放射性化学、核医学技术及生物制药领域，具体地说，涉及一种cldn18.2特异性肽的筛选及核素标记的靶向cldn18.2的肿瘤显影剂及其应用。

背景技术：

1、胃癌给全球人类的健康造成了极大的威胁，尤其是在亚洲国家。虽然早期胃癌可以通过手术治愈，但由于其起病隐匿，80％-90％的患者在诊断时已进展为晚期或转移性胃癌，治疗选择有限。近年来，靶向治疗在胃癌的治疗中取得了显著效果，但随着治疗的进行，耐药问题逐渐显现，为晚期胃癌患者寻找新的药物靶点迫在眉睫。

2、cldn18.2在正常组织仅表达于胃粘膜分化上皮细胞，但在胃癌和胰腺癌中高表达，这种限制性表达使其成为继her2之后有吸引力的胃癌治疗靶点。zolbetuximab是第一个抗cldn18.2的单抗，其可以利用抗体依赖性细胞毒性(adcc)和补体依赖性细胞毒性(cdc)作用杀死肿瘤细胞。fast和mono研究均显示，zolbetuximab在表达cldn18.2的晚期胃或胃食管交界处(g/gej)腺癌患者中表现出良好的耐受性和抗肿瘤活性。

3、胃癌是一种高异质性的肿瘤，同一患者肿瘤内部和患者之间的肿瘤异质性是靶向药物治疗的主要障碍。因此，准确、全面地评估cldn18.2表达水平，以最大限度地识别和筛选潜在受益患者是一个紧迫的问题。而目前，检测cldn18.2蛋白表达水平主要依靠免疫组化(ihc)，但ihc样本多取自内镜活检或穿刺等侵入性检查，取材部位和数量有限，且由于异质性问题，ihc不足以全面评价cldn18.2的表达。pet/ct是一种非侵入性诊断工具，利用核素探针的正电子发射断层扫描(pet)信号和计算机断层扫描(ct)的定位能力，能够实时准确地显示cldn18.2在病灶中的分布和表达，从而能够帮助临床医生快速筛查患者以指导其进行精准诊断和治疗。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种基于噬菌体展示技术所得的cldn18.2特异性肽的筛选、特异性验证及核素探针的构建与评价。通过对cldn18.2特异性肽进行生物筛选和放射性标记，可以得到cldn18.2的特异性小分子肽及新型核素探针。筛选流程简单，周期较短且成本低。该肽能特异性识别并结合cldn18.2蛋白。所构建的核素探针性质稳定，制作简易，安全性高；体内显像表明，其可以有效示踪到cldn18.2阳性肿瘤的在体分布。这说明其具有发展成检测cldn18.2表达水平及分布情况的有效工具的潜力，为临床医生筛选cldn18.2阳性患者提供助力。

2、本发明的第一方面提供一种多肽，为如下(a)或(b)的多肽或其药学上可接受的盐化物，

3、(a)具有如下任一所示氨基酸序列的多肽：

4、t25：nswlipr(seq id no：1)

5、t9：aarlptn(seq id no：2)

6、t37：gwhsipr(seq id no：3)

7、t51：aglimgq(seq id no：4)

8、c7：cdgrpdrac(seq id no：5)

9、t20：wslgytg(seq id no：6)

10、t21：wslghpg(seq id no：7)

11、t23：rslgdpg(seq id no：8)

12、c1：ctdkasssc(seq id no：8)

13、c18：cstlhqklc(seq id no：10)

14、l1：dvfehpftqwwy(seq id no：11)

15、(b)任一如(a)所示氨基酸序列经过替换和/或增加和/或缺失一个或几个氨基酸且具有与(a)相同功能的衍生多肽。

16、本发明的多肽是经由噬菌体展示技术淘选所获得，并在细胞水平验证了其特异性。

17、本发明的第二方面提供上述的多肽或其药学上可接受的盐化物作为靶向cldn18.2的结合肽的应用。

18、本发明的第三方面提供一种药物组合物，其含有：上述的多肽或其药学上可接受的盐化物，以及药物可接受的载体或赋形剂。

19、本发明的第四方面提供一种放射性核素标记的cldn18.2蛋白靶向肽，其为放射性核素标记的上述的多肽或其药学上可接受的盐化物。

20、根据本发明，所述放射性核素可以为诊断用放射性核素或治疗用放射性核素。所述诊断用放射性核素可以为68ga、64cu、18f、86y、90y、89zr、111i n、99mtc、11c、123i、125i和124i中的至少一种。所述治疗用放射性核素可以为177lu、125i、131i、211at、111i n、153sm、186re、188re、67cu、212pb、225ac、213bi、212bi和212pb中的至少一种。

21、本发明的所述放射性核素优选为18f、68ga或碘的放射性同位素；所述碘的放射性同位素优选为124i、123i、125i或131i。

22、根据本发明一种优选实施方式，所述靶向肽是通过所述的多肽或其药学上可接受的盐化物以6-氨基己酸介导、与双功能螯合剂偶联后，进行放射性标记得到。

23、所述双功能螯合剂包括但不限于nota或dota。

24、本发明的第五方面提供述的放射性核素标记的cldn18.2蛋白靶向肽的制备方法：

25、(a)当采用碘的放射性同位素(如124i)标记时，所述制备方法包括：

26、将多肽化合物与碘的放射性同位素的盐于indogen包被的反应瓶中混合后进行标记反应，得到目标化合物；所述多肽化合物、碘的放射性同位素的盐和indogen的用量比为(20-50μg):(3×107-1.5×108bq):(100μg)；优选地，使用hcl溶液调整碘的放射性同位素的盐溶液ph至7-8，所述标记反应的条件优选为常温反应7-8min；更具体地，使用0.01m hcl调整碘的放射性同位素的盐溶液ph至7-8，取5μl t37与18.5mbq 124i于indogen包被的反应瓶中混合后，常温反应7-8分钟，得到目标化合物。

27、(b)当采用68ga标记时，所述制备方法包括：

28、用hcl溶液淋洗68ga至缓冲液中，将dota-多肽化合物前体溶液加入上述体系，混匀，92-97℃反应12-18分钟，得到目标化合物，其中所述dota-多肽化合物前体溶液的浓度为8-12mg/ml，以无菌注射用水为溶剂；更具体地，取3ml 0.05m hcl溶液淋洗68ga至195μl1m naac中；将5μldota-t37前体加入上述体系，混匀，95℃反应15分钟,得到目标化合物，即68ga标记的靶向cldn18.2的肿瘤显影剂，其中dota-t37溶液的浓度为10mg/ml，以无菌注射用水为溶剂。

29、(c)当采用18f标记时，所述制备方法包括：

30、以0.08-0.12mm，ph4.0的醋酸缓冲液为溶剂，配制1.5-2.5mm alcl3溶液，取0.08-0.12mm，ph4.0的醋酸缓冲液以及所述alcl3溶液混合，然后加入740-3700mbq 18f，室温放置4-8分钟，再加入nota-多肽化合物溶液，108-112℃下反应8-12分钟，得到目标化合物，其中所述dota-多肽化合物前体溶液的浓度为8-12mg/ml，以0.08-0.12mm，ph 4.0的naac缓冲液为溶剂。更具体地，以0.1mm，ph4.0的醋酸缓冲液为溶剂，配制2mm alcl3溶液，取0.1ml0.1mm，ph4.0的醋酸缓冲液，6μl alcl3溶液，加入740-3700mbq 18f(0.1ml)，室温放置5分钟，再加入5μl nota-t37溶液，110℃下反应10分钟，得到目标化合物，即al18f标记的靶向cldn18.2的肿瘤显影剂；其中，nota-t37溶液的浓度为10mg/ml，以0.1m，ph 4.0的naac缓冲液为溶剂。

31、本发明的第六方面提供上述的放射性核素标记的cldn18.2蛋白靶向肽在制备靶向cldn18.2的pet/ct分子诊断显像剂中的应用。

32、本发明的第七方面提供一种靶向肿瘤细胞cldn18.2蛋白的诊断或治疗放射性药物，其包含放射性核素标记的cldn18.2蛋白靶向肽。

33、以上所述三种目标化合物均使用sep-pak light c18 cartridge进行分离纯化，使目标化合物的放射性化学纯度大于99％。使用前sep-pak light c18cartridge需用无水乙醇和超纯水活化。纯化过程中先将目标化合物负载于sep-pak light c18 cartridge之上，再用超纯水洗脱放射性杂质，最后用80％乙醇洗脱出目标化合物，并用生理盐水进行稀释使乙醇含量低于10％，即得到靶向cldn18.2的肿瘤显影剂。

34、本发明提供的筛选方案构建成功，筛选得到11条cldn18.2特异性肽，针对t37肽进行进一步研究，证实t37肽具有cldn18.2特异性，68ga标记的靶向cldn18.2的肿瘤显影剂68ga-dota-t37性质稳定、显像效果较好、对cldn18.2具有特异性，经进一步临床前动物实验研究证实，68ga-dota-t37在正常kunming雌性小鼠体内的生物分布实验结果表明，其在小鼠体内清除迅速并主要通过尿路排泄，在非靶组织和器官中摄取低且代谢快，小动物pet/ct显像实验结果表明，在荷瘤模型小鼠中，68ga-dota-t37在cldn18.2高表达的肿瘤组织内具有较高摄取，而在cldn18.2阴性的bgc823荷瘤裸鼠体内，肿瘤组织几乎没有68ga-dota-t37摄取，其有望成为具有良好应用前景的cldn18.2特异性显影剂。

35、本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。