一种靶向稻瘟病菌VAD1基因的dsRNA分子

本发明涉及生物，主要涉及利用sigs技术制备水稻抗稻瘟核酸农药，即涉及一种用于防治稻瘟病菌的dsrna。

背景技术：

1、据估计，病原微生物、病毒、害虫等造成的全球作物产量损失平均达30％以上(alexander et al.,2017；keulemans et al.,2019；oerke and dehne,2004)。加强病虫害防控可有效保障作物稳产增产，目前，化学农药的使用仍是防控病虫害的重要方法。然而，化学农药的过度使用对人类健康和环境带来的的不利影响，如病虫抗(耐)药性的产生和农药对非靶标生物的毒害作用等，受到越来越多的关注(rank&koch,2021；tudi etal.,2021)。因此，开发绿色、高效、安全的新型农药，建立环境友好的新型植物保护策略，成为农业可持续发展的必由之路。

2、水稻(oryza sativa)是最主要的粮食作物。稻瘟病菌(引起的稻瘟病是水稻上最重要的病害之一，可造成每年大约10-30％的水稻产量损失(pennisi,2010)。抗性品种的选育仍是目前有效控制稻瘟病的主要方法之一，但是由于抗性基因的不断突变导致选育工作的任务变得繁重且耗费时间很长(singh et al.,2012；wang&valent,2017)。近年来，以稻瘟病菌为研究对象，大量参与致病过程的功能基因得到鉴定和阐释。使得利用这些基因为靶标，进行特异性的靶向防控成为可能。

3、在rnai为基础发展的核酸农药以其物种特异性、低毒性、环境友好性、时间比选育工作较短等巨大优势逐渐成为研究的热点。核酸农药的有效物质主要为dsrna,喷施在植物表面的dsrna，通过直接或间接的方式被靶标生物细胞摄取后，rnai信号在靶标生物内移动并被不断放大，触发基因沉默，这种方式为喷雾诱导的基因沉默(spraying induced genesilence,sigs)。近年来，sigs技术的研究逐渐在多种植物病原真菌中得到开展，取得了一定的进展。选取合适的靶标基因，设计和筛选具有对病原菌有抑制效果的dsrna或sirna是sigs技术的关键。至目前，在不同的植物病原真菌中报道了少量有效的rna片段，尝试利用片段结构设计、与农药或纳米材料混配等的研究也有开展。但至目前，仍没有可以直接作为商品药剂开发的rna分子。因此，在致病关键基因基础上，发掘和鉴定更多的针对不同靶标基因的rna分子仍是rnai农药和靶向防控技术研究的前提和重点。

4、dexd/h-box家族是一类rna解旋酶，根据保守基序的不同分为4个亚家族。dexd/h-box家族蛋白存在于几乎所有的真核生物和多数原核生物中，参与rna剪接、转录、转运、翻译、降解等重要生命过程，与植物的形态建成、胁迫应答，动物的生殖、人类癌症以及病原微生物的致病过程等息息相关。稻瘟病菌dexd/h-box家族蛋白vad1基因已被作为水稻抗稻瘟的靶点，在本课题组的前期探索中，通过higs载体转化进入水稻细胞后培育出以vad1为靶点的转基因的抗稻瘟水稻，申请专利的专利号为cn115927410a。但是由于转基因作物在市场上接受程度底，在推广过程中受到阻碍，现需要寻找到水稻抗稻瘟更易被公众接受的替代方案。

技术实现思路

1、针对以上问题，基于sigs技术，研制4个以vad1为靶标基因的dsrna分子，是通过筛选出可轻易扩增、高效靶向的vad1基因片段，转录出的dsrna分子。得到的dsrna分子可制备成核酸农药喷雾，喷洒在植株的茎秆、叶上，被稻瘟病菌吸收，靶向沉默vad1基因，稻瘟病菌致病性被抑制，孢子萌发受到抑制，从而实现防治稻瘟病菌的作用。

2、为达到上述目的。本发明采用以下方案实现：

3、本发明提供一种用于防治稻瘟病菌的dsrna，dsrna由vad1的序列片段转录而来，所述vad1具有如seq id:1所示的dna序列。

4、进一步的，本发明所提供的dsrna包括dsvad1-1、dsvad1-4、dsvad1-5、dsvad1-6的一种或多种，所述的dsvad1-1、dsvad1-4、dsvad1-5、dsvad1-6具有如seq id:2～5所示的rna序列。可以采用包括dsvad1-1、dsvad1-4、dsvad1-5、dsvad1-6中一种或多种的dsrna制备的核酸农药喷洒在水稻植株的茎、杆、叶上，防治稻瘟病菌。除了水稻，稻瘟病菌还能侵染小麦、大麦、稷等多种禾本科作物和杂草，因此本发明所提供的dsrna还可以应用于上述的多种禾本科作物中。

5、进一步的，本发明所提供的dsrna包括dsvad1-5，经过实验证明，dsvad1-5具有最好的抑制稻瘟病菌孢子萌发的效果，以及最好的抑制稻瘟病菌致病性效果。

6、另一方面，本发明提供一种用于制备防治稻瘟病菌的dsrna的引物组，引物组包括seq id:6所示的上游引物和seq id:7所示的下游引物、seq id:8所示的上游引物和seqid:9所示的下游引物、seq id:10所示的上游引物和seq id:11所示的下游引物、seq id:12所示的上游引物和seq id:13所示的下游引物中的一种或多种。采用以上引物组对vad1基因进行扩增获得相应的vad1基因片段，以扩增出的基因片段转录成dsrna分子即可获得本发明所提供的用于靶向vad1基因的dsrna。经过筛选，以上引物可以稳定地扩增出有效的vad1基因的片段，而在实施例中也提到vad1基因的一些片段的扩增难度较大，如果选择不能稳定扩增的片段作为本发明dsrna的转录模板序列，则会导致重复性低的问题。在一些可行的方式中，采用的转录试剂盒为megascripttmrnai(thermo fisher scientific)。

7、进一步的，引物组包括seq id:10所示的上游引物和seq id:11所示的下游引物。采用此引物组可稳定扩增出的基因片段经转录便可得到dsvad1-5。

8、另一方面，本发明提供一种靶向稻瘟病毒vad1基因的dsrna的制备方法，构建引物组，使用引物组在vad1基因扩增出vad1片段，转录vad1片段获得dsrna，在转录过程中经过扩增在5’端带有t7启动子序列，所述引物组包括seq id:6所示的上游引物和seq id:7所示的下游引物、seq id:8所示的上游引物和seq id:9所示的下游引物、seq id:10所示的上游引物和seq id:11所示的下游引物、seq id:12所示的上游引物和seq id:13所示的下游引物中的一种或多种；所述dsrna包括dsvad1-1、dsvad1-4、dsvad1-5、dsvad1-6的一种或多种。

9、另一方面，本发明提供一种用于防治稻瘟病菌的核酸农药，包含靶向稻瘟病菌vad1基因的dsrna，所述dsrna为本发明所提供的dsrna。核酸农药中可以是任意本发明所提供的4种不同序列的dsrna分子，也可以是4种不同序列dsrna分子的任意组合。

10、另一方面，本发明提供一种防治稻瘟病菌的方法，采用含有dsrna的核酸农药喷洒在植株茎秆、叶上，抑制稻瘟病菌孢子萌发、抑制稻瘟病菌的致病性，所述核酸农药为本发明所提供的核酸农药。经实验证明，稻瘟病菌可以从外界环境中吸收rna。稻瘟病菌可以从环境中吸收本发明所提供的dsrna，从而被抑制vad1基因表达，实现稻瘟防治。

11、另一方面，本发明提供一种dsrna用于制备防治稻瘟病毒的制剂，或抑制稻瘟病毒孢子萌发、抑制稻瘟病毒致病性的制剂的用途，所述dsrna为本发明所提供的dsrna。

12、本发明所具有的有益效果如下：

13、1.提供了一种可以用于防治稻瘟病菌的dsrna，可以制备成核酸农药喷施在农作物上，避免培育为转基因作物而被消费群体排斥。

14、2.本发明所提供的dsrna分子可以有效地抑制稻瘟病菌致病性，可以抑制稻瘟病菌孢子萌发，从而有效地防止稻瘟病菌。

15、3.本发明筛选多个用于转录dsrna分子的vad1基因片段，经过对比，靶向vad1后抑制稻瘟病菌致病性、抑制孢子萌发效果最好的是dsvad1-5片段。

16、4.本发明提供了稻瘟病菌也可以吸收外界环境中存在的rna分子，为利用sigs技术防治稻瘟提供新思路。

17、5.本发明提供了sigs中发挥作用的rna分子的产生方式及制备方法，提供了在防治稻瘟病菌中sigs技术的应用方式。