一种肿瘤恶性积液体外诊断试剂盒及其使用方法与流程

本发明属于肿瘤患者药物敏感性敏感性筛选，具体涉及一种肿瘤恶性积液体外诊断试剂盒及其使用方法。

背景技术：

1、癌症恶性积液是癌症患者晚期的恶性表现，免疫检查点抑制剂(ici)，是免疫治疗的一种有效方式，一般作为晚期癌症患者的最后治疗手段，目前的指南中将ici药物治疗拓展至肿瘤治疗的各个阶段。ici通过改善肿瘤周围免疫微环境，从而激活体内免疫细胞活性，以达到抗肿瘤目的。

2、免疫检查点抑制剂可逆转t细胞耗竭状态。t细胞耗竭的主要原因为免疫抑制性受体表达增加，如pd-1、ctla-4、tim-3等，免疫检查点抑制剂可以阻断这些信号，逆转耗竭的t细胞活性，恢复肿瘤微环境肿瘤浸润t细胞(til)功能。t细胞耗竭显然在肿瘤免疫、感染免疫、自身免疫都发挥着重要作用。jean-christophe beltra(pmid32396847)工作发现处于耗竭中期的t细胞，对于免疫检查点抑制剂治疗的响应最好，且能够恢复t细胞的细胞毒性功能。因而，基于t细胞耗竭分期(或者耗竭t细胞亚型)的伴随诊断，应该对于更好发挥免疫检查点抑制剂治疗效果，能够起到积极作用。

3、肿瘤浸润淋巴细胞(tumorinfiltrating lymphocyte,til)，含有针对肿瘤特异性突变抗原的t细胞，t细胞是杀伤肿瘤最强的免疫细胞。肿瘤患者的til细胞由于各种原因受到了抑制，不能有效杀伤肿瘤。通过一些体外培养方法把这些til细胞扩增、处理，再回输给患者，发挥抗肿瘤的作用，这样的疗法就叫做til细胞疗法。由于t细胞在长期不断地处于与入侵病原体或肿瘤细胞的战斗中，持久的暴露于抗原/炎症下，一批一批t细胞逐渐失去效应功能，记忆t细胞特征也开始缺失，这一过程，就被称为t细胞耗竭(t cell exhaustion)。

4、选择合适的患者人群进行治疗，从而获得更好的抗肿瘤效应及临床获益，是肿瘤临床研究的一大挑战，特别是对于接受ici治疗的患者。pd-l1表达、肿瘤突变负荷(tmb)与微卫星不稳定(msi)是ici治疗研究较为深入的生物学标志物，其他一些潜在的生物标志物也得到发掘和验证。

5、其中，pd-l1表达是现阶段官方和大家都认可度比较高的生物标志物了。由于历史发展的各种原因，pd-l1表达在指南和药品说明书中出现了多种表达方式：tps(任何强度pd-l1膜染色肿瘤细胞占肿瘤细胞的百分比)、cps(每100个肿瘤细胞中pd-l1染色的肿瘤细胞和肿瘤相关的免疫数之和)、ips(任何强度pd-l1膜和胞浆染色肿瘤相关免疫细胞占所有肿瘤相关免疫细胞百分比)都是以染色pd-l1表达并作为生物标志物的指标。

6、然而，现有技术只发现ici可逆转t细胞的耗竭状态，可使t细胞恢复活力杀伤肿瘤细胞，对于肿瘤的治疗具有极大的临床价值。但现有技术仍未公开对于不同肿瘤或者病人如何选择合适的ici药物。因此，对于如何提供用于筛选合适的ici药物治疗诸如肿瘤恶性积液疾病等肿瘤的试剂盒，仍然是本领域技术人员亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、本发明提供了一种肿瘤恶性积液体外诊断试剂盒及其使用方法，旨在解决现有技术中针对治疗肿瘤恶性积液，难以选择合适的ici药物及其组合的技术问题。

2、一方面，本发明提供了一种肿瘤恶性积液体外诊断试剂盒，包括共培养扩增试剂、肿瘤恶性积液til共刺激激活试剂、肿瘤细胞扩增试剂和t细胞逆耗竭激活试剂；

3、共培养扩增试剂包括dmem培养基和肿瘤恶性积液til扩增剂；

4、肿瘤细胞扩增试剂包括dmem培养基；

5、所述t细胞逆耗竭激活试剂包括若干份不同的ici。

6、优选的方案，dmem培养基添加有胎牛血清和广谱抗生素；所述胎牛血清体积占dmem培养基体积的10-50％，所述广谱抗生素体积占dmem培养基体积的0.5-3％；所述dmem培养基的ph值为6.7-7.6。

7、优选的方案，所述肿瘤恶性积液til扩增剂为白介素2。

8、基于上述方案，所选用的白介素2可提高人体对病毒、细菌、真菌、原虫等感染的免疫应答白细胞，能够刺激til生长和分化，并使其杀伤活性增强，进而清除肿瘤细胞和病毒感染细胞，是扩增til细胞的重要因子。

9、优选的方案，所述肿瘤恶性积液til共刺激激活试剂为cd3/cd28抗体磁珠。

10、基于上述方案，所选用的cd3/cd28抗体磁珠主要用于人til细胞活化等功能，可以提供til细胞激活所需的主要信号和协同刺激信号。

11、优选的方案，所述ici为pd-1抗体、ctla-4抗体、lag3抗体和tim3抗体中的至少一种。

12、基于上述方案，pd-1抗体、ctla-4抗体、lag3抗体和tim3抗体在肿瘤恶性积液细胞中高度表达，可通过激活免疫系统杀伤肿瘤恶性积液细胞；使用不同的ici类型及其组合，针对不同患者的肿瘤恶性积液细胞筛选出更敏感的ici药物。

13、本发明另一方面还提供了一种用于肿瘤恶性积液细胞体外诊断的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

14、s1、til细胞的扩增：将肿瘤恶性积液til扩增剂加入dmem培养基获得共培养扩增试剂；将肿瘤恶性积液离心并弃掉上清溶液后获得包含肿瘤细胞和til细胞的混合细胞，加入共培养扩增试剂稀释细胞获得混合细胞溶液，将混合细胞溶液移至细胞培养板中，放入37℃且含有浓度为5％co2的培养箱中，培养期间，每隔3-4天替换一次培养板孔内的共培养扩增试剂直至til细胞扩增的数量达标后进行分孔培养；

15、s2、til的共刺激激活：将步骤s1中细胞培养板孔内扩增后的混合细胞溶液混匀，将悬浮的til细胞溶液加入离心管中进行离心，细胞培养板孔内留下贴壁的肿瘤细胞部分；向含有贴壁的肿瘤细胞部分的培养板孔中加入胰蛋白酶进行消化，将使用胰蛋白酶消化后的肿瘤细胞使用pbs溶液清洗，清洗后弃掉上清液后获得肿瘤细胞沉淀；再加入肿瘤细胞扩增试剂对肿瘤细胞重悬获得重悬后的肿瘤细胞；取一部分肿瘤细胞加入含有til细胞溶液的离心管中进行混合离心，将离心后的混合细胞中加入肿瘤恶性积液til共刺激激活试剂，并移至细胞培养板孔内进行激活获得效应细胞；

16、s3、靶细胞的制备：取剩下的步骤s2中获得肿瘤细胞移至新的细胞培养板中，加入肿瘤细胞扩增试剂并放入37℃且含有浓度为5％co2的培养箱中继续扩增获得靶细胞；

17、s4、t细胞的逆耗竭激活：将步骤s2中的效应细胞和步骤s3中的靶细胞分别离心后使用肿瘤细胞扩增试剂重悬获得效应细胞沉淀和靶细胞沉淀，将效应细胞沉淀和靶细胞沉淀移至细胞培养板孔内获得共培养体系，各个孔中加入不同的ici激活t细胞；

18、所述共培养体系包括100数量份的效应细胞和1数量份的靶细胞。

19、优选的方案，在步骤s1中，每隔3-4天替换一次培养板孔内的共培养扩增试剂的过程中，从细胞培养板的孔内液面上部吸弃500-750μl，再添加500-750μl新鲜的共培养扩增试剂。

20、基于上述方案，少量吸取更换共培养扩增试剂可确保til扩增过程中，有足够的til扩增剂和足够的营养供给以保证til扩增速度快。

21、优选的方案，在步骤s1中，所述肿瘤细胞的培养时间为5-7天，直至孔板底部覆盖til且til覆盖率达到细胞培养板孔底体积的80％区域后进行分孔培养。

22、基于上述方案，将肿瘤细胞培养5-7天以保证足够的til扩增量；直至孔板底部til覆盖率达到细胞培养板孔底体积的80％区域后进行分孔培养以保证分孔培养后每个孔内有充足且有活力的肿瘤细胞。

23、优选的方案，在步骤s1中，在步骤s1中使用共培养扩增试剂稀释混合细胞溶液稀释至使其密度为1*106个/ml。

24、基于上述方案，在步骤s1中，使用共培养扩增试剂稀释混合细胞溶液稀释至使其密度为1*106个/ml，以保证将til细胞移至细胞培养板孔内进行扩增时，每个孔内能提供有足够的空间和营养；将扩增好的til细胞移至细胞培养板孔内进行激活时能够将细胞培养板孔内的til细胞全部激活为效应细胞。

25、优选的方案，在步骤s2中，所述pbs溶液包括8质量份nacl、0.2质量份kcl1.44质量份na2hpo4、0.24质量份kh2po4和800体积份蒸馏水，该溶液ph为7.4；1体积份：1质量份＝1ml:1g。

26、基于上述方案，使用pbs溶液可使肿瘤细胞保持盐平衡和适宜的ph。

27、本发明的有益效果为：

28、本发明提供的一种用于肿瘤恶性积液体外诊断的试剂盒，使用肿瘤恶性积液til扩增剂和肿瘤恶性积液til共刺激激活试剂将肿瘤恶性积液til扩增并激活，获得的til细胞数量多且细胞活度高，通过添加不同份的ici刺激t细胞，逆转t细胞耗竭状态并恢复活力，恢复并增强了t细胞杀伤肿瘤恶性积液中肿瘤细胞的能力。通过体外模拟人体内肿瘤恶性积液细胞被t细胞杀伤的过程，直观地展示ici抑制剂激活耗竭t细胞，恢复t细胞杀伤肿瘤恶性积液中肿瘤细胞的能力，为临床相关领域治疗是否选择ici抑制剂，如何选择ici抑制剂类型或组合提供了参考。

29、本发明中肿瘤恶性积液体外诊断的试剂盒的使用方法，向肿瘤恶性积液中加入共培养扩增试剂将til细胞扩增，获得大量的til细胞，提高试剂盒的灵敏度和准确度；通过肿瘤恶性积液til共刺激激活试剂将扩增后的til细胞刺激活化，使til细胞中的t细胞恢复到具有与体内活化t细胞相当的特性，再与肿瘤细胞共同培养，并加入不同份ici阻断使t细胞耗竭的信号，恢复t细胞的效应功能，对比使用不同ici激活t细胞的效果，快速选择最佳的ici药物，为肿瘤恶性积液患者提供更合适的治疗方案。