抗PD-1抗体与突变体IL-2或与IL-15的免疫缀合物的制作方法

发明领域本发明一般涉及免疫缀合物,特别是包含突变体白介素-2多肽和结合pd-1的抗体的免疫缀合物。另外,本发明涉及编码该免疫缀合物的多核苷酸分子,和包含此类多核苷酸分子的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于生成该突变体免疫缀合物的方法,包含它们的药学组合物,及其用途。

背景技术：

0、发明背景

1、白介素-2(il-2),也称作t细胞生长因子(tcgf),是一种15.5kda球状糖蛋白,在淋巴细胞生成,存活和稳态中发挥中枢作用。它具有133个氨基酸的长度且由形成它的功能必不可少的四级结构的四个反平行的两亲性的α螺旋组成(smith,science 240,1169-76(1988)；bazan,science 257,410-413(1992))。来自不同物种的il-2的序列可见于ncbirefseq no.np000577(人),np032392(小鼠),np446288(大鼠)或np517425(黑猩猩)。

2、il-2通过结合il-2受体(il-2r)来介导它的作用,后者由多至三个个别亚基组成,它们的不同联合能生成在它们对il-2的亲和力方面不同的受体形式。α(cd25),β(cd122),和γ(γc,cd132)亚基的联合产生三聚体的,高亲和力的il-2受体。由β和γ亚基组成的二聚体的il-2受体称作中等亲和力il-2r。α亚基形成单体的低亲和力il-2受体。虽然二聚体的中等亲和力il-2受体以比三聚体的高亲和力受体大约低100倍的亲和力结合il-2,但是二聚体的和三聚体的il-2受体变体均能够在il-2结合后传递信号(minami et al.,annurev immunol 11,245-268(1993))。因此,α亚基cd25对于il-2信号传导不是必需的。它赋予对它的受体的高亲和力结合,而β亚基cd122和γ亚基对于信号转导是至关重要的(krieget al.,proc natl acad sci 107,11906-11(2010))。包括cd25的三聚体的il-2受体由(静息的)cd4+叉头盒p3(foxp3)+调节性t(treg)细胞表达。它们也在常规的激活的t细胞上瞬时诱导,而在静息的状态这些细胞仅仅表达二聚体的il-2受体。treg细胞在体内始终表达最高水平的cd25(fontenot et al.,nature immunol 6,1142-51(2005))。

3、il-2主要由激活的t细胞合成,特别是cd4+辅助t细胞。它刺激t细胞增殖和分化,诱导细胞毒性t淋巴细胞(ctl)生成和外周血淋巴细胞分化成细胞毒性细胞和淋巴因子激活的杀伤(lak)细胞,促进t细胞表达细胞因子和溶胞分子,推动b细胞增殖和分化和b细胞合成免疫球蛋白,和刺激天然杀伤(nk)细胞生成,增殖和激活(综述于例如waldmann,natrev immunol 6,595-601(2009)；olejniczak and kasprzak,med sci monit 14,ra179-89(2008)；malek,annu rev immunol 26,453-79(2008))。

4、它在体内扩充淋巴细胞群体和提高这些细胞的效应器功能的能力赋予il-2以抗肿瘤效果,使得il-2免疫疗法成为某些转移性癌症的一种有吸引力的治疗选项。因此,高剂量il-2治疗已经批准用于具有转移性肾细胞癌和恶性黑素瘤的患者。

5、然而,il-2在免疫应答中具有双重功能,在于它不仅介导效应细胞的扩充和活性,而且决定性地牵涉维持外周免疫耐受。

6、外周自身耐受下面的一种主要机制是t细胞中il-2诱导的激活诱导的细胞死亡(aicd)。aicd是完全激活的t细胞通过它经由细胞表面表达的死亡受体诸如cd95(也称作fas)或该tnf受体的啮合而经历编程性细胞死亡的一种过程。当在增殖期间表达高亲和力il-2受体(在先前暴露于il-2之后)的抗原激活的t细胞经由t细胞受体(tcr)/cd3复合物受到抗原的再刺激时,fas配体(fasl)和/或肿瘤坏死因子(tnf)的表达受到诱导,使得细胞对fas介导的凋亡易感。这种过程是il-2依赖性的(lenardo,nature 353,858-61(1991))且经由stat5介导。通过t淋巴细胞中的aicd的过程,不仅能针对自身抗原,而且能针对明显不是宿主的构成的部分的持久抗原,诸如肿瘤抗原建立耐受。

7、而且,il-2还牵涉维持外周cd4+cd25+调节性t(treg)细胞(fontenot et al.,nature immunol 6,1142-51(2005)；d’cruz andklein,nature immunol 6,1152-59(2005)；maloy and powrie,nature immunol 6,1171-72(2005)),它们也称作遏制t细胞。它们遏制效应t细胞破坏它们的(自身)靶物,或是经由细胞-细胞接触通过抑制t细胞辅助和激活,或是经由释放免疫遏制性细胞因子,诸如il-10或tgf-β。消减treg细胞显示出增强il-2诱导的抗肿瘤免疫力(imai et al.,cancer sci 98,416-23(2007))。

8、因此,il-2对于抑制肿瘤生长并非最佳的,因为在il-2存在下或是所生成的ctl可能将肿瘤识别为自身并经历aicd或是免疫应答可能受到il-2依赖性treg细胞抑制。

9、与il-2免疫疗法有关的另一项担忧是由重组人il-2治疗产生的副作用。接受高剂量il-2治疗的患者频繁经历重度心血管,肺,肾,肝,胃肠,神经学,皮肤,血液学和全身不良事件,要求密集监测和住院管理。大多数这些副作用可以通过发生所谓的血管(或毛细血管)渗漏综合征(vls)来解释,血管通透性的一种病理性升高,导致多个器官中的流体外渗(引起例如肺和皮肤水肿和肝细胞损伤)和血管内流体消减(引起血压下降和心率补偿性升高)。除了il-2停药以外,vls没有治疗。已经在患者中测试低剂量il-2方案以避免vls,然而以亚最佳治疗结果为代价。认为vls是由自il-2激活的nk细胞释放促炎性细胞因子,诸如肿瘤坏死因子(tnf)-α引起的,然而最近显示il-2诱导的肺水肿源自il-2对表达低至中等水平的功能性αβγil-2受体的肺内皮细胞的直接结合(krieg et al.,proc nat acad sciusa 107,11906-11(2010))。

10、已经采取数种办法来克服这些与il-2免疫疗法有关的问题。例如,已经发现在体内il-2与某些抗il-2单克隆抗体的组合增强il-2的治疗效果(kamimura et al.,jimmunol 177,306-14(2006)；boyman et al.,science 311,1924-27(2006))。在一种备选办法中,以多种方式突变il-2以降低它的毒性和/或提高它的功效。hu等人(hu et al.,blood 101,4853-4861(2003),美国专利公开文本no.2003/0124678)用色氨酸替代il-2的位置38中的精氨酸残基以消除il-2的血管通透性活性。shanafelt等人(shanafelt etal.,nature biotechnol 18,1197-1202(2000))将天冬酰胺88突变成精氨酸以增强对t细胞的选择性胜过nk细胞。heaton等人(heaton et al.,cancer res 53,2597-602(1993)；美国专利no.5,229,109)引入两处突变(arg38ala和phe42lys)以降低自nk细胞分泌促炎性细胞因子。gillies等人(美国专利公开文本no.2007/0036752)替代il-2中有助于对中等亲和力il-2受体的亲和力的三个残基(asp20thr,asn88arg,和gln126asp)以降低vls。gillies等人(wo 2008/0034473)还通过氨基酸替代arg38trp和phe42lys突变il-2与cd25的界面以降低与cd25的相互作用和treg细胞的激活来增强功效。为了相同的目的,wittrup等人(wo2009/061853)生成具有增强的对cd25的亲和力但不活化该受体,从而作为拮抗剂起作用的il-2突变体。所引入的突变目的在于破坏与受体的β和/或γ亚基的相互作用。

11、一种为了克服上文提到的与il-2免疫疗法有关的问题(由诱导vls引起的毒性,由诱导aicd引起的肿瘤耐受,和由激活treg细胞引起的免疫遏制)而设计的特定突变体il-2多肽描述于wo 2012/107417。丙氨酸对il-2的位置42处的苯丙氨酸残基,丙氨酸对位置45处的酪氨酸残基和甘氨酸对位置72处的亮氨酸残基的替代本质上消除这种突变体il-2多肽对il-2受体的α亚基(cd25)的结合。

12、进一步对于上文提到的办法,可通过将il-2选择性靶向肿瘤来改善il-2免疫疗法,例如以包含结合在肿瘤细胞上表达的抗原的抗体的免疫缀合物的形式。已经描述了数种此类免疫缀合物(见例如ko et al.,j immunother(2004)27,232-239；klein et al.,oncoimmunology(2017)6(3),e1277306)。

13、然而,肿瘤可能能够通过脱落,突变或下调抗体的靶抗原来逃避此类靶向。而且,在积极排除淋巴细胞的肿瘤微环境中,肿瘤靶向性il-2可能没有取得与效应细胞,诸如细胞毒性t淋巴细胞(ctl)的最佳接触。

14、如此,仍然需要进一步改进il-2免疫疗法。一种可规避肿瘤靶向的问题的办法是直接将il-2靶向效应细胞,特别是ctl。

15、ghasemi等人描述了il-2和nkg2d结合蛋白的一种融合蛋白(ghashemi et al.,nat comm(2016)7,12878),用于将il-2靶向携带nkg2d的细胞,诸如天然杀伤(nk)细胞。

16、编程性细胞死亡蛋白1(pd-1或cd279)是cd28受体家族的一个抑制性成员,该家族还包括cd28,ctla-4,icos和btla。pd-1是一种细胞表面受体且在激活的b细胞,t细胞,和髓样细胞上表达(okazaki et al.(2002)curr opin immunol 14:391779-82；bennett etal.(2003)j immunol 170:711-8)。pd-1的结构是一种单体1型跨膜蛋白,由免疫球蛋白可变样胞外域和含有免疫受体基于酪氨酸的抑制性基序(itim)和免疫受体基于酪氨酸的转换基序(itsm)的胞质域组成。已经鉴定出pd-1的两种配体,pd-ll和pd-l2,它们显示在结合pd-1后下调t细胞激活(freeman et al.(2000)j exp med 192:1027-34；latchman et al.(2001)nat immunol 2:261-8；carter et al.(2002)eur j immunol32:634-43)。pd-ll和pd-l2均是b7同系物,结合pd-1但不结合其它cd28家族成员。pd-1的一种配体,pd-ll在多种人癌症中是丰富的(dong et al.(2002)nat med 8:787-9)。pd-1和pd-ll之间的相互作用导致肿瘤浸润性淋巴细胞减少,t细胞受体介导的增殖降低,和癌性细胞的免疫逃脱(donget al.(2003)jmol med 81:281-7；blank et al.(2005)cancer immunol immunother 54:307-314；konishi et al.(2004)clin cancer res 10:5094-100)。通过抑制pd-1与pd-ll的局部相互作用可逆转免疫遏制,而且在同样阻断pd-1与pd-l2的相互作用时效果是叠加的(iwai et al.(2002)proc natl acad sci usa 99:12293-7；brown etal.(2003)jimmunol 170:1257-66)。

17、结合pd-1的抗体描述于例如pct专利申请no.pct/ep2016/073248。

技术实现思路

0、发明概述

1、本发明提供一种将具有对于免疫疗法的有利特性的突变体形式的il-2靶向免疫效应细胞,诸如细胞毒性t淋巴细胞,而非肿瘤细胞的新颖办法。通过突变体il-2分子与结合pd-1的抗体的缀合来实现对免疫效应细胞的靶向。

2、设计了本发明中使用的il-2突变体来克服与il-2免疫疗法有关的问题,特别是由诱导vls引起的毒性,由诱导aicd引起的肿瘤耐受,和由激活treg细胞引起的免疫遏制。在如上所述防止肿瘤逃脱肿瘤靶向以外,将il-2突变体靶向免疫效应细胞可进一步提高优先激活ctl胜过免疫遏制性treg细胞。通过使用结合pd-1的抗体,可另外逆转由pd-1与它的配体pd-l1的相互作用诱导的t细胞活性遏制,从而进一步增强免疫应答。

3、chen等人描述了一种包含抗pd-l1抗体阿特珠单抗的il-2融合蛋白(chen etal.,biochem biophys res comm(2016)480,160-165)。

4、值得注意的是,本发明的包含结合pd-1的抗体的免疫缀合物显示与相似的靶向pd-l1的免疫缀合物相比显著卓越的体内抗肿瘤功效(见本文中下文实施例3)。

5、在一个一般方面,本发明提供一种包含结合pd-1的抗体和经由il-2rβγ发信号的多肽的免疫缀合物。该经由il-2rβγ发信号的多肽特别是il-2多肽或il-15多肽。在第一个方面,本发明提供一种包含突变体il-2多肽和结合pd-1的抗体的免疫缀合物,其中该突变体il-2多肽是包含氨基酸替代f42a,y45a和l72g(编号方式相对于人il-2序列seq id no:19)的人il-2分子。

6、在又一个方面,本发明提供一种包含突变体il-2多肽和结合pd-1的抗体的免疫缀合物,其中该突变体il-2多肽是包含氨基酸替代f42a,y45a和l72g(编号方式相对于人il-2序列seq id no:19)的人il-2分子；且其中该抗体包含(a)重链可变区(vh),其包含包含seqid no:1的氨基酸序列的hvr-h1,包含seq id no:2的氨基酸序列的hvr-h2,包含seq idno:3的氨基酸序列的hvr-h3,和在依照kabat编号方式的位置71-73处包含seq id no:7的氨基酸序列的fr-h3,和(b)轻链可变区(vl),其包含包含seq id no:4的氨基酸序列的hvr-l1,包含seq id no:5的氨基酸序列的hvr-l2,和包含seq id no:6的氨基酸序列的hvr-l3,或其中该抗体包含(a)重链可变区(vh),其包含包含seq id no:8的氨基酸序列的hvr-h1,包含seq id no:9的氨基酸序列的hvr-h2,和包含seq id no:10的氨基酸序列的hvr-h3,和(b)轻链可变区(vl),其包含包含seq id no:11的氨基酸序列的hvr-l1,包含seq id no:12的氨基酸序列的hvr-l2,和包含seq id no:13的氨基酸序列的hvr-l3。

7、在另一个方面,本发明提供一种包含突变体il-2多肽和结合pd-1的抗体的免疫缀合物,其中该突变体il-2多肽是包含氨基酸替代f42a,y45a和l72g(编号方式相对于人il-2序列seq id no:19)的人il-2分子；且其中该抗体包含(a)包含与seq id no:14的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链可变区(vh),和(b)包含与选自由seq id no:15,seq id no:16,seq id no:17,和seq id no:18组成的组的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的轻链可变区(vl)。

8、在依照本发明的免疫缀合物的一些实施方案中,该突变体il-2多肽进一步包含氨基酸替代t3a和/或氨基酸替代c125a。在一些实施方案中,该突变体il-2多肽包含seq idno:20的序列。在一些实施方案中,该免疫缀合物包含不多于一条突变体il-2多肽。在一些实施方案中,该抗体包含由第一和第二亚基构成的fc域。在一些此类实施方案中,该fc域是igg类,特别是igg1亚类fc域,和/或该fc域是人fc域。在一些实施方案中,该抗体是igg类,特别是igg1亚类免疫球蛋白。

9、在其中该免疫缀合物包含fc域的一些实施方案中,该fc域包含促进fc域的第一和第二亚基联合的修饰。在一些实施方案中,在该fc域的第一亚基的ch3域中氨基酸残基用具有更大侧链体积的氨基酸残基替换,由此在该第一亚基的ch3域内生成隆起,其可放置在第二亚基的ch3域内的空腔中,且在该fc域的第二亚基的ch3域中氨基酸残基用具有更小侧链体积的氨基酸残基替换,由此在该第二亚基的ch3域内生成空腔,在其内可放置第一亚基的ch3域内的隆起。在一些实施方案中,在该fc域的第一亚基中位置366处的苏氨酸残基用色氨酸残基替换(t366w),且在该fc域的第二亚基中位置407处的酪氨酸残基用缬氨酸残基替换(y407v)且任选地位置366处的苏氨酸残基用丝氨酸残基替换(t366s)且位置368处的亮氨酸残基用丙氨酸残基替换(l368a)(编号方式依照kabat eu索引)。在一些此类实施方案中,在该fc域的第一亚基中另外位置354处的丝氨酸残基用半胱氨酸残基替换(s354c)或位置356处的谷氨酸残基用半胱氨酸残基替换(e356c),且在该fc域的第二亚基中另外位置349处的酪氨酸残基用半胱氨酸残基替换(y349c)(编号方式依照kabat eu索引)。在一些实施方案中,该突变体il-2多肽在它的氨基末端氨基酸处与该fc域的亚基之一,特别是该fc域的第一亚基的羧基末端氨基酸融合,任选地经由接头肽。在一些此类实施方案中,该接头肽具有seq id no:21的氨基酸序列。

10、在其中该免疫缀合物包含fc域的一些实施方案中,该fc域包含一处或多处降低对fc受体,特别是fcγ受体的结合,和/或效应器功能,特别是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)的氨基酸替代。在一些此类实施方案中,所述一处或多处氨基酸替代在一个或多个选自l234,l235,和p329(kabat eu索引编号方式)的组的位置处。在一些实施方案中,该fc域的每个亚基包含氨基酸替代l234a,l235a和p329g(kabat eu索引编号方式)。

11、在一些实施方案中,依照本发明的免疫缀合物包含包含与seq id no:22的序列至少约80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的多肽,包含与seq id no:23或seq id no:24的序列至少约80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的多肽,和包含与seq id no:25的序列至少约80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中,该免疫缀合物本质上由通过接头序列连接的突变体il-2多肽和igg1免疫球蛋白分子组成。

12、本发明进一步提供一种或多种编码本发明的免疫缀合物的分离的多核苷酸,一种或多种包含所述多核苷酸的载体(特别是表达载体),和包含所述多核苷酸或所述载体的宿主细胞。

13、还提供的是一种生成包含突变体il-2多肽和结合pd-1的抗体的免疫缀合物的方法,其包含(a)在适合于表达该免疫缀合物条件下培养本发明的宿主细胞,并任选地(b)回收该免疫缀合物。本发明还提供的是一种包含突变体il-2多肽和结合pd-1的抗体的免疫缀合物,其是通过所述方法生成的。

14、本发明进一步提供一种包含本发明的免疫缀合物和药学可接受载剂的药学组合物,和使用本发明的免疫缀合物的方法。

15、特别地,本发明涵盖依照本发明的免疫缀合物,其用作药物,而且,其用于治疗疾病。在一个特定实施方案中,所述疾病是癌症。

16、本发明还涵盖的是依照本发明的免疫缀合物在制造用于治疗疾病的药物中的用途。在一个特定实施方案中,所述疾病是癌症。

17、进一步提供的是一种治疗个体中的疾病的方法,其包含对所述个体施用治疗有效量的包含处于药学可接受形式的依照本发明的免疫缀合物的组合物。在一个特定实施方案中,所述疾病是癌症。

18、还提供的是一种刺激个体的免疫系统的方法,其包含对所述个体施用有效量的包含处于药学可接受形式的依照本发明的免疫缀合物的组合物。