基于不对称RPA的CRISPR/Cas12a检测试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于生物病毒和细菌检测领域，具体涉及一种不对称rpa的crispr/cas12a检测方法。

背景技术：

1、crispr/cas12a目前在生物检测和传感领域中占有重要地位，由于其独有的特异性和灵敏度。具体而言，该系统凭借pam位点和crrna引导cas12a寻找和识别靶标。在识别正确的靶标后，cas12a的顺式和反式切割活性被激活分别切割靶标和周围的任意的单链dna(ssdna)。通过这样的过程，crispr/cas12a系统在核酸检测领域中受到了巨大的关注。rpa结合crispr/cas12a实现了对核酸的快速检测。crispr/cas12a比色技术结合rt-rpa对sasr-cov进行快速检测，准确性达到95.12％，检测限低至50copies每反应。rpa结合crispr/cas12a的一锅式反应检测非洲猪瘟和羊痘病毒。crispr/cas12a与功能化的aunps结合，对grapevine red-blotch viral实现可视化检测。由此可见，crispr/cas12a在检测方法和生物传感器领域中有重要地位。更重要的是，crispr/cas12a的靶标可以是ssdna也可以是双链dna(dsdna)。不同的是，在识别dsdna时，必须有pam位点才能激活cas12a的活性；而识别ssdna时，不需要pam位点。因此在dsdna检测中，比如一些肿瘤核酸标志物、细菌以及其耐药性和双链dna病毒，会受到pam位点的限制。由于检测位点不一定存在pam位点，这会极大地限制crispr/cas12a的应用范围。为了解决这个问题，研究人员想出多种无pam位点限制的方法。比如，在rpa的引物5’端设计磷酸集团，利用lambda消化带有5’磷酸的链的能力消化rpa产物，产生ssdna结合cas12a的活性。另外，polya polymerase(i)对mirna的3’端添加ploy a尾巴，再通过反转录形成cdna，进行rpa扩增，其产物带上了pam位点来激活cas12a。还有在forward inner primer(fip)的f2and f1c的连接处添加了pam序列，利用lamp对靶标扩增，实现无pam位点限制的crispr/cas12a检测。然而这些方法设计复杂或者需要繁冗的步骤来增添pam位点或者产生单链dna来摆脱pam位点的限制，这是耗时的并且不利于快速检测的。

2、牛结节性皮肤病病毒lsdv，与绵羊痘病毒(gtpv)和山羊痘病毒(sppv)同属于羊痘病毒。他们会分别感染牛、山羊和绵羊，引起动物们高烧、厌食、消瘦，在皮肤上会出现突起，严重影响产奶量和毛皮质量。他们被世界卫生组织定为法定报告疫病，给农业带来巨大的经济损失。更重要的是，他们三者之间基因同源性高达97％，是很难区分的。经过仔细比对，发现在基因varv b22r上，lsdv比gtpv和sppv多36-38bp。基于此区域，我们设计方法去特异性识别lsdv。

3、结核分枝杆菌(mtb)是引起结核病(tb)的疾病，是对人类生命的严重威胁，它具有高度的毒性和传染性。先前的研究人员已经研究了治疗效果良好的药物，如异烟肼(inh)、利福平(rif)。然而，在没有诊断和经验性治疗的情况下广泛使用药物导致结核分枝杆菌出现显著的耐药性。这对完全根除结核分枝杆菌构成了巨大的挑战。世卫组织制定了到2035年结束结核病流行，到2050年根除结核病的目标。区分耐药性和野生型结核分枝杆菌尤为重要。研究发现，耐rif的tb(mdr-tb-rif)菌株在rna聚合酶β-亚基(rpob)基因中有超过87个突变。其中，531密码子(c531)和526密码子(c526)的突变与耐药性密切相关，突变率高达56％和25％。因此，基于这些密码子对于区分突变型tb(mt-tb)和野生型tb(wt-tb)至关重要。

技术实现思路

1、为此，本发明开发了一种不对称rpa(asy-rpa)结合crispr/cas12a方法消除pam位点的限制，并用于lsdv检测和区分mt-tb和wt-tb。asy-rpa以dsdna为模板，可以生成大量的ssdna。cas12a识别ssdna的能力被充分用于检测dsdna病毒lsdv。asy-rpa在技术上解决了pam限制的问题。更重要的是，asy-rpa可以在恒温下快速反应，不依赖大型仪器，可以与crispr/cas12a协同发生单管反应。此外，如果没有pam位点，crispr/cas12a可以在背景信号很少的情况下区分出ssdna上的错配。基于这一性能，crispr/cas12a与asy-rpa结合，鉴定出了wt-tb和mt-tb。该方法的检测限为1fm。这种灵敏和特异的方法为根除和治疗结核病提供了一种实用的技术，同时也为没有pam的其他核酸提供了新的想法。目前国内外尚无asy-rpa结合crispr/cas12a方法用于lsdv、mt-tb和wt-tb检测。因此，建立asy-rpa结合crispr/cas12a的检测方法，这对于海关口岸、养殖场、基层动物疫病防控机构对ldsv的快速和准确检测，以及鉴定wt-tb和mt-tb具有重要意义。

2、鉴于此，本发明的第一个目的是建立不对称rpa结合crispr/cas12a的检测试剂盒，拓展crispr/cas12a的应用范围。第二个目的是提供一种基于不对称rpa结合crispr/cas12a对lsdv的检测试剂盒及检测方法，第三个目的是提供基于不对称rpa结合crispr/cas12a鉴别耐药性tb和野生型tb的试剂盒和方法。

3、为了实现第一个目的，本发明采用的技术方案是：基于不对称rpa的crispr/cas12a检测试剂盒，包括不对称rpa体系和crispr/cas12a体系，所述不对称rpa体系中包括限制引物f和过量引物r，限制引物f的浓度：过量引物r的浓度为1:5～1:15。

4、所述限制引物f的浓度：过量引物r最优的浓度为1:10μm。

5、为了实现第二个目的，本发明采用的技术方案是：检测牛结节性皮肤病病毒试剂盒，包括核苷酸序列为seq id no.1的lsdv限制引物f，核苷酸序列为seq id no.2的lsdv过量引物r，核苷酸序列为seq id no.3的lsdv-crrna，核苷酸序列为seq id no.4的lsdv-ssdna reporter。

6、进一步，基于以上试剂盒，不对称rpa体系包括2μl待测核酸，2μl 1μmlsdv限制引物f，2μl 10μm lsdv过量引物r，一管冻干粉，20μl溶解剂，20μl ddh2o和2.5μl激活剂；

7、crispr/cas12a体系包括2μl 2μm的cas12a，2μl 0.5μm的tb-crrna1，1μl 20μm的ssdna reporter和1×的反应缓冲液。

8、进一步，所述不对称rpa体系加载在pcr试管的底部，所述crispr/cas12a体系放置在试管盖上。

9、进一步，采用lsdv-ssdna reporter作为信标分子，两端修饰hex和bhq1，最终体系在ls-55spectrophoto fluorometer记录荧光信号，激发波长为490nm。

10、lsdv检测方法如下：

11、将asy-rpa系统加载在pcr管的底部，并将crispr/cas12a系统放置在试管盖上。asy-rpa系统由2μl 1μm限制引物f，2μl 10μm过量引物r，一管冻干粉，20μl溶解剂，20μlddh2o和2.5μl激活剂，混合均匀，置于pcr管的底部。crispr/cas12a体系包含2μl 1μm的cas12a、2μl 1μm的lsdv-crrna、1μl 10μm的ssdna reporter和1×的反应缓冲液，这些缓冲液均匀混合并加载在pcr管盖上。将2μl的核酸加入到试管底部，37℃孵育30min。然后，将帽盖上的crispr/cas12系统离心到试管底部，37℃孵育20min。对lsdv的varv b22r基因进行特异地检测。

12、结果判定，所述crispr/cas12a体系有信号为lsdv阳性样本，没有信号为阴性样本。

13、为了实现第三个目的，本发明采用的技术方案是：区分耐利福平和野生型结核分枝杆菌的试剂盒，包括核苷酸序列为seq id no.5的tb限制引物f，核苷酸序列为seq idno.6的tb过量引物r，核苷酸序列为seq id no.7的tb-crrna1，核苷酸序列为seq id no.8的tb-crrna2，核苷酸序列为seq id no.9的tb-ssdna reporter。

14、进一步，不对称rpa体系包括2μl待测核酸，tb限制引物f和tb过量引物r各2.5μl，20μl ddh2o和1.5μl的激活剂，tb限制引物f的浓度：tb过量引物r的浓度为1:5～1:15。

15、crispr/cas12a-crrna1体系包含2μl 2μm的cas12a，2μl 0.5μm的tb-crrna1，1μl20μm的ssdna reporter和1×的反应缓冲液。

16、crispr/cas12a-crrna2体系包含2μl 1μm的cas12a，2μl 0.5μm的tb-crrna2，1μl20μm的ssdna reporter和1×的反应缓冲液。

17、采用tb-ssdna reporter作为信标分子，两端修饰fam和bhq1，最终体系置于恒温荧光仪上在37℃采集信号。

18、进一步，构建两个不对称rpa体系分别加载在两个pcr试管的底部，crispr/cas12a-crrna1体系和crispr/cas12a-crrna2体系分别放置在两个pcr管的盖上。

19、区分耐利福平和野生型结核分枝杆菌的检测方法为：采用单管反应，将asy-rpa置于底部，将crispr/cas12a置入盖子。asy-rpa体系包括0.5μm tb限制引物f和5μm tb过量引物r各2.5μl，20μl ddh2o，混合分成2管进行2次反应。加入2μl的核酸和1.5μl的激活剂，在37℃下孵育40min。将两个crispr/cas12a系统分别加载到两个pcr管的盖上。crispr/cas12a-crrna1体系包含2μl 2μm的cas12a，2μl 0.5μm的tb-crrna1，1μl的20μm的ssdnareporter和1×的反应缓冲液。crrna2体系包含2μl 1μm的cas12a，2μl0.5μm的tb-crrna2，1μl 20μm的ssdna reporter和1×的反应缓冲液。将crispr/cas12a系统简单离心到管底反应，置于荧光仪中，在37℃下收集荧光。

20、结果判定：crispr/cas12a-crrna1体系和crispr/cas12a-crrna2体系均有信号为野生型结核分枝杆菌；仅有crispr/cas12a-crrna1体系有荧光信号为耐利福平结核分枝杆菌；crispr/cas12a-crrna1体系和crispr/cas12a-crrna2体系均没有信号则为阴性。

21、以上核苷酸序列如下所示：

22、seq id no.1为：atctgctacaagttttaacgaactta

23、seq id no.2为：tgaatgtgatctcatatccttattg

24、seq id no.3为：

25、aauuucuacuaaguguagauuaaaaaaagaaaaaaaaaaag

26、seq id no.4为：

27、hex-tattatt-bhq1

28、seq id no.5为：

29、tcaagagttcttcggcaccagccagctgagc

30、seq id no.6为：

31、cggcacgctcacgtgacagaccgccg

32、seq id no.7为：

33、aauuucuacuaaguguagaugaccagaacaacccgcuguc

34、seq id no.8为：

35、aauuucuacuaaguguagaucacaagcgccgacugucg

36、seq id no.9为：

37、fam-tattatt-bhq1。

38、本发明的原理是：在asy-rpa中，限制性引物f的浓度远远小于过量引物r的浓度。在扩增前期，引物不断被消耗以产生dsdna产物。当限制性引物f被消耗完后，剩余的多余过量引物r以dsdna为模板产生ssdna。ssdna无论存在或不存在pam位点都可以激活cas12a。因此，ssdna激活cas12a的反式裂解活性，产生荧光信号。利用该方法检测dsdna病毒lsdv。理论上，在asy-rpa中，只有过量的引物介导产物在扩增后期呈线性增加，如图1(b)和(c)所示，不像图1(a)中对称rpa(sym-rpa)呈指数增长。因此，asy-rpa的扩增效率低于sym-rpa。但是asy-rpa可以解决pam对crispr/cas12a限制的问题。此外，已有研究表明crispr/cas12a具有错配不耐受。耐利福平结核病经常在rpob基因上发生突变，特别是在密码子526和531上。有20bp识别序列的crrna可以覆盖两个密码子。并且，在它们之前没有可识别的pam序列。因此，在图1(c)中，asy-rpa结合crispr/cas12a用于区分耐药mt-tb和wt-tb。由于突变是随机的，wt-tb被识别为涵盖所有突变可能性来避免漏检。当crrna与asy-rpa的ssdna产物完全配对时，激活cas12a反应。当突变存在时，则不能完全配对导致没有荧光。这种正向检测的方法对于突变检测更为合理和全面。为结核病的检测提供了一种新的思路和方法。

39、本发明的优点是(1)、asy-rpa可以在短时间内产生大量的ssdna去激活crispr/cas12a，消除了pam位点的限制并扩展cas12a的应用；(2)、asy-rpa结合crispr/cas12a在一管内反应，避免了开盖造成的气溶胶污染，并且操作简单利于推广；(3)、高灵敏度：asy-rpa结合crispr/cas12a的信号放大能力使得方法有高的灵敏度，对lsdv实际检测限低至1.21×101copies·μl-1，对tb的实际检测限低至1fm。高的灵敏度可以解决由于丰度低造成的假阴性现象。(4)高特异性：crispr/cas12a体系可以高特异性识别lsdv和wt-tb，阳性检出率达100％；(5)、设计简单和操作简便：asy-rpa和crispr/cas12a设计简单并且操作简便；(6)、用途广：方法具有可编程性，改变引物序列和crrna序列可以广泛应用于多种病毒、细菌及其他物种的检测；(7)便捷：使用便携式荧光仪可以实现即时检测(poct)。