一种以麦芽糊精为单一碳源发酵生产普鲁兰多糖的方法以及普鲁兰多糖含量的快速检测方法与流程

本发明涉及生物，尤其涉及一种以麦芽糊精为单一碳源发酵生产普鲁兰多糖的方法以及普鲁兰多糖的快速检测方法。

背景技术：

1、普鲁兰多糖是一种线性葡聚糖，其具有良好的生物相容性，成膜性和生物降解性，对人体和环境无害，常用于化妆品、食品加工、农业、医药、环保等领域。

2、目前，国内普鲁兰多糖的工业化生产上多采用以蔗糖为底物进行培养发酵。蔗糖的高成本限制了普鲁兰多糖的应用与发展。探究非蔗糖为碳源的普鲁兰多糖的发酵生产工艺将有助于提升普鲁兰多糖的市场竞争力。另外，普鲁兰多糖的检测方法主要分为三种：醇沉法、液相法和酸解法即快速检测方法。醇沉法的操作便捷、成本低廉，但其在醇沉过程当中，容易将蛋白等杂质一同醇沉下来而影响测定的准确性。再次，液相法作为国标中注明的普鲁兰多糖的检测手段，准确性高，但是处理样品以及结果需要消耗大量的时间。酸解法则将快速性以及准确性实现了更好的统一。如刘飞研究的以蔗糖为底物发酵生产普鲁兰多糖的快速检测方法，其精密度与准确性均较高，可以在1h内检测普鲁兰多糖的含量。

3、本发明首次提供了以麦芽糊精为单一碳源发酵生产普鲁兰多糖的工艺，并生产出了较高产量的普鲁兰多糖，相比于蔗糖为底物进行发酵，生产单位千克普鲁兰多糖的成本降低了约73.30%。并用快速检测方法检测普鲁兰多糖，能够快速准确的测定普鲁兰多糖的含量，拓展了快速检测方法即酸解法的应用范围。

技术实现思路

1、本发明旨在利用保藏号为cgmccno.7055的出芽短梗霉菌( aureobsidium  pullulans)生产普鲁兰多糖的基础上，开发出一种以麦芽糊精为单一碳源发酵生产普鲁兰多糖的方法，并可用快速检测方法检测普鲁兰多糖的含量，本发明中发酵得到的普鲁兰多糖含量最高可达78.04g/l。

2、具体来说，本发明提供了一种以麦芽糊精为单一碳源生产普鲁兰多糖的方法，包括以下步骤：

3、(1)菌种活化：将出芽短梗霉菌株转接至pda固体斜面培养基中活化；

4、(2)种子培养：将步骤（1）中活化的菌种转接至种子培养基中，进行种子培养，得到种子培养液；

5、(3)发酵培养：将步骤（2）制得的种子培养液接种到发酵培养基中发酵培养；

6、(4)普鲁兰多糖含量的测定：将步骤(3)所得的发酵液离心后取上清液，使用快速检测方法检测单位体积发酵液中普鲁兰多糖的含量。

7、优选地，所述步骤（1）中，固体斜面培养基由以下成分组成：新鲜土豆 200g/l，琼脂 20g/l，葡萄糖 20g/l，自然 ph。

8、优选地，步骤（1）中，菌种活化的条件为：28℃恒温培养箱中培养3-4d。

9、优选地，所述步骤（1）中所述pda固体斜面培养基于121℃灭菌20min。

10、优选地，步骤（2）中，所述种子培养基为：麦芽糊精 20-120g/l，酵母抽提物1-8g/l，nacl 1-5g/l，k2hpo40-5g/l，mgso4·7h2o 0.1-1.0g/l；

11、更优选地，所述种子培养基为：麦芽糊精 40g/l，nacl 1g/l，酵母抽提物6.9g/l，k2hpo41.2g/l，mgso4·7h2o 0.3g/l，溶剂为去离子水，配成种子培养基后用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌20min。

12、优选地，步骤（2）中，种子培养的条件为：28℃、ph5.0-7.0的条件下、转速为180rpm振荡培养15-24小时；更优选地，步骤（2）中，种子培养的条件为：于28℃、ph5.5的条件下、转速为180rpm振荡培养15-24小时；更优选地，所述步骤（2）中种子培养的条件为：于28℃、ph5.5条件下，转速为180rpm振荡培养18h。

13、优选地，步骤（3）中，所述发酵培养基包括以下成分：麦芽糊精 100-180g/l，酵母抽提物2-10g/l，nacl 0-10g/l，k2hpo44-8g/l，mgso4·7h2o 0.0-2.5g/l。在ph5-7条件下，溶剂为去离子水，配成发酵培养基后用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌20min。

14、优选地，所述步骤（3）中种子液以1-9％(v/v)接种量接种至发酵的培养基中；更优选地，种子液的接种量为3％(v/v)。

15、优选地，步骤（3）中，所述步骤(3)的发酵培养为摇瓶发酵培养；

16、摇瓶发酵培养时，发酵培养条件为：在发酵前24h温度32℃、在发酵后72h温度28℃、ph为5.0-7.0、转速180rpm的条件下培养96h；更优选地，ph选择为6.0。

17、优选地，所述步骤(4)中，使用酸解法快速检测普鲁兰多糖产量的方法为：

18、第一步：取适量发酵液与去离子水等比例稀释，于离心管中均匀后在 5000 r/min条件下离心15 min。取上清液用去离子水稀释 50 倍，用生物传感器测定初始葡萄糖值，记为 a（g/l）。

19、第二步：取上述上清液 5 ml，加入 2.4 mol/l 盐酸 5 ml，混匀，沸水浴 3 min，取 1 ml 反应液，用酸碱溶液调整 ph 至 6-8，加去离子水稀释 25 倍，用生物传感器测定葡萄糖值，记为 b（g/l）。

20、第三步：取第一步上清液 5 ml，加入 4.8 mol/l 盐酸 5 ml，沸水浴 30 min，取1ml 反应液，用酸碱溶液调整 ph 至 6-8，加去离子水稀释 25 倍，用生物传感器测定葡萄糖值，记为 c（g/l）。

21、计算式如下：

22、（1）

23、（2）

24、其中：ma为麦芽糊精浓度，单位是g/l；pu为普鲁兰多糖浓度，单位是g/l；162为去水单糖的分子量；180为葡萄糖的分子量。

25、相关原理在其它专利中已有报道。

26、出芽短梗霉菌的保藏信息如下：

27、保藏编号为 cgmcc no.7055，保藏日期为2012年12月25日；保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心-cgmcc；分类命名为出芽短梗霉 aureobasidiumpullulans，保藏单位地址：北京市朝阳区大屯路。本发明的有益效果是：

28、本发明以保藏号为cgmccno.7055的出芽短梗霉菌( aureobsidium pullulans)为出发菌株，通过对种子以及发酵培养基的优化，配制出适合以麦芽糊精为单一碳源生产普鲁兰多糖的培养条件，生产出高产量的普鲁兰多糖，并用快速检测方法准确反映普鲁兰多糖的含量，最终降低普鲁兰多糖的生产成本。相比以蔗糖为碳源发酵生产普鲁兰多糖，培养基质的成本实现了大幅度降低约73.30%。与其它生产和检测普鲁兰多糖的方法相比，本发明生产普鲁兰多糖的成本较低且所用工艺简单，而且快速检测方法可以准确并快速的测定普鲁兰多糖的含量。