一种人白细胞介素-5重组蛋白及其制备方法与流程

本发明涉及重组蛋白表达与纯化，具体涉及一种人白细胞介素-5重组蛋白及其制备方法。

背景技术：

1、人白细胞介素-5(interleukin-5，il-5)是1980年由takasu等人首先发现的一种分泌型细胞因子，它主要由激活的th2细胞(辅助性t细胞2)、嗜酸性粒细胞和肥大细胞产生。人白细胞介素-5对嗜酸性粒细胞的生长、成熟、分化、活化、迁移起着最主要的作用，并可以通过抑制凋亡延长嗜酸性粒细胞的生存；在单独或与转化生长因子b联合作用的条件下，人白细胞介素-5可以通过体液免疫应答促进活化的b细胞产生iga。

2、流行病学研究显示，th2型细胞因子相关的过敏性疾病(如哮喘、特异性皮炎、过敏性腹泻和其他特应性疾病)近年来呈现盛行的趋势，其特征是出现炎症，即t细胞和粒细胞(包括肥大细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞)明显浸润。th2细胞产生的人白细胞介素-5作为过敏性炎症发生过程中的关键细胞因子，通过与异源二聚体人白细胞介素-5受体(il-5r)结合会导致嗜酸性粒细胞过量增殖累积。嗜酸性粒细胞通过产生主要碱性蛋白、嗜酸性阳离子蛋白(ecp)和嗜酸性粒细胞源性神经毒素(edn)，在保护性免疫反应中发挥重要作用，然而主要碱性蛋白和嗜酸性阳离子蛋白有溶解细胞的能力，会造成机体的组织损伤。以往的研究中也发现，嗜酸性粒细胞可能通过流入肿瘤生长部位参与肿瘤监测，如在肺癌、黑色素瘤、纤维肉瘤等疾病发展过程中，嗜酸性粒细胞的浸润可能抑制肿瘤的形成和帮助转移病灶的清除。因此，对患者血液中人白细胞介素-5的及时检测，在炎症或过敏性疾病的诊断和急性排斥反应或肿瘤的治疗预后中具有广泛的应用前景。

3、现有的人白细胞介素-5重组蛋白主要通过昆虫杆状病毒系统与cho系统生产获得，昆虫杆状病毒系统与cho系统的表达周期长，从获得表达质粒到完成蛋白表达需要1个月甚至更长的时间，而且在上述真核系统中得到的人白细胞介素-5重组蛋白是完全糖基化的活性蛋白。但研究表明，真核系统的糖基化过程对人白细胞介素-5拥有生物活性是非必要的，人白细胞介素-5的生物活性主要是与其c端残基和二聚体结构有关，所以使用原核系统表达也能够得到具有完全活性的人白细胞介素-5重组蛋白。

4、原核系统表达与真核系统表达相比，具有操作流程简单快捷、表达产量高、成本低、适合工业化等优点。由于人白细胞介素-5重组蛋白不需要真核系统的进一步加工修饰即可获得完全活性，所以原核表达是更适合人白细胞介素-5重组蛋白快速生产的方式。但现有的原核表达人白细胞介素-5重组蛋白(如febs lett.(1993)27；331(1-2):49-52.doi:10.1016/0014-5793(93)80295-6./protein expr purif.(1997)11(1):86-94.doi:10.1006/prep.1997.0785.)，普遍采用了表达完整序列并通过多步纯化的方式，制备的人白细胞介素-5重组蛋白与天然蛋白相比，反应性并无优势，且纯化过程较繁琐，不易纯化，普遍需要通过3-4种凝胶层析柱纯化才能获得较高纯度的目的蛋白，周期长、成本高。

5、因此，急需找到一种制备具有更高活性，更高反应性，且更易纯化的人白细胞介素-5重组蛋白的方法，用于在疾病诊断和治疗预后阶段对人白细胞介素-5进行定量检测具有重要意义。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种人白细胞介素-5重组蛋白及其制备方法，通过选取合适的能形成抗原表位的序列进行连续表达，得到编码人白细胞介素-5重组蛋白抗原表位的核酸分子，构建重组载体并在大肠杆菌表达系统中高效表达，制备的目的蛋白活性更高；并筛选和优化了变性清洗液和复性工艺，显著提高了蛋白收率并保持蛋白生物活性，经一步柱纯化即可获得与人白细胞介素-5蛋白标准品活性更高的目的蛋白，具有重要的科学意义和临床应用价值。

2、一方面，本发明提供了一种用于编码人白细胞介素-5重组蛋白的核酸分子，所述核酸分子包括重复两次的ala45-cys63、ser75-thr82、lys103-arg110和val124-ser134序列，所述ala45-cys63、ser75-thr82、lys103-arg110和val124-ser134分别具有如seq idno:1～4所示的核苷酸序列。

3、本发明根据ncbi官网查询获得人白细胞介素-5的mrna序列(seq id no:7)，从人白细胞介素-5的mrna序列中选取除信号肽以外的ile20-ser134(seq id no:8)序列，基于疏水性、蛋白二级结构、抗原决定簇等参数，对人白细胞介素-5的抗原表位进行预测，筛选到4段(ala45-cys63(seq id no:1)，ser75-thr82(seq id no:2)，lys103-arg110(seq idno:3)，val124-ser134(seq id no:4))可能形成抗原表位的序列进行连续表达。发现采用这4段序列构建的核酸分子，能够表达具有更高生物活性的目的蛋白。

4、由于人白细胞介素-5具有二聚体形式，因此本发明还尝试针对这4段序列使用柔性连接肽重复表达两次，研究证明，重复表达两次能显著提高目的蛋白的生物活性。

5、进一步地，所述核酸分子具有如seq id no:5所示的核苷酸序列。

6、另一方面，本发明提供了一种重组载体，所述重组载体包括如上所述的核酸分子。

7、本发明中，重组载体具有多克隆位点，是一种可以调控外源基因表达的分子生物学载体。

8、在一些方式中，所述重组载体的空载体包括pet21a(+)。

9、再一方面，本发明提供了一种大肠杆菌表达系统，所述大肠杆菌表达系统用于转化如上所述的重组载体。

10、在一些方式中，所述大肠杆菌表达系统包括已de3溶源化的大肠杆菌宿主菌。

11、在一些方式中，所述大肠杆菌宿主菌为bl21(de3)。

12、再一方面，本发明提供了一种人白细胞介素-5重组蛋白，所述重组蛋白由如上所述的核酸分子编码获得。

13、本发明所述人白细胞介素-5重组蛋白采用如上所述的大肠杆菌表达系统表达获得。

14、进一步地，所述重组蛋白具有如seq id no:6所示的氨基酸序列。

15、再一方面，本发明提供了一种人白细胞介素-5重组蛋白的制备方法，通过构建包含如上所述的核酸分子的重组载体，再经原核系统表达获得。

16、进一步地，所述制备方法包括以下步骤：

17、(1)将核酸分子插入大肠杆菌表达载体得到重组载体；

18、(2)重组载体转化到大肠杆菌表达系统，得到菌体溶液；

19、(3)菌体溶液中加入变性裂解液进行裂解，离心，得到蛋白溶解液；

20、(4)蛋白溶解液经柱纯化，洗脱获得蛋白洗脱液；

21、(5)蛋白洗脱液中加入复性液，超滤浓缩，透析，制得人白细胞介素-5重组蛋白。

22、进一步地，所述方法包括：

23、(1)将编码人白细胞介素-5重组蛋白的核酸分子插入大肠杆菌表达载体，获得重组载体；

24、(2)重组载体转化入大肠杆菌表达系统，诱导培养；

25、(3)收集所述大肠杆菌表达系统的菌体，含变性裂解液重悬，经过破碎离心获得蛋白溶解液(包涵体溶解液)；

26、(4)将包涵体溶解液进行柱纯化，得到蛋白洗脱液；

27、(5)将蛋白洗脱液缓慢加入复性液中，使人白细胞介素-5重组蛋白在低温条件下充分复性，再进行浓缩和透析，得到复性的人白细胞介素-5重组蛋白。

28、在一些方式中，步骤(1)所述大肠杆菌表达载体包括pet21a(+)。

29、在一些方式中，步骤(1)所述核酸分子插入大肠杆菌表达载体的bamhi和xhoi限制性酶切位点。

30、在一些方式中，步骤(2)所述大肠杆菌表达系统包括已de3溶源化的大肠杆菌宿主菌。

31、在一些方式中，所述大肠杆菌宿主菌为bl21(de3)。

32、在一些方式中，步骤(2)所述转化的方法为化学转化。

33、进一步地，步骤(3)所述变性裂解液包括pbs(磷酸盐缓冲液)、尿素、咪唑、tritonx-100(聚乙二醇辛基苯基醚)和pmsf(苯甲基磺酰氟)。

34、进一步地，步骤(3)所述变性裂解液包括0.005～0.015m的pbs、浓度为6～10m的尿素、浓度为4～6mm的咪唑、浓度为0.5～1.5％的triton x-100和0.5～1.5mm的pmsf，ph7.5～8.5。

35、在一些方式中，步骤(3)所述变性裂解液为，0.01m pbs、8m尿素、5mm咪唑、1％triton x-100、1mm pmsf(苯甲基磺酰氟)，ph 8.0。所述变性裂解液能够将溶液中的人白细胞介素-5重组蛋白尽量溶解并防止所述目的蛋白降解。

36、在一些方式中，步骤(3)所述破碎的方法为超声破碎。

37、进一步地，步骤(4)所述柱纯化包括变性清洗和变性洗脱；所述变性清洗液能够尽量将其他蛋白清洗掉，柱上只保留所述目的蛋白。

38、在一些方式中，步骤(4)所述变性清洗的变性清洗液包括0.005～0.015m pbs、6～10m尿素和30～100mm咪唑，ph7.5～8.5。

39、在一些方式中，步骤(5)所述的变性清洗液为：0.01m pbs、8m尿素和80mm咪唑，ph8.0。经过研究证明，针对人白细胞介素-5重组蛋白，所述变性清洗液相比其他咪唑浓度条件下的变性清洗液更有利于在保证目的蛋白不损失的情况下尽可能减少杂蛋白的含量。

40、在一些方式中，步骤(4)所述变性洗脱的变性洗脱液包括0.005～0.015m pbs，6～10m尿素和400～600mm咪唑，ph7.5～8.5。所述变性洗脱液能够将人白细胞介素-5重组蛋白从亲和柱完全洗脱。

41、在一些方式中，步骤(4)所述柱纯化的方法包括亲和层析。

42、在一些方式中，所述亲和层析采用镍柱进行。

43、进一步地，步骤(5)所述复性液含有tris(三羟甲基氨基甲烷)，ph为8.0。

44、在一些方式中，步骤(5)所述的复性液包括40～60mm tris、0.4～0.6m nacl、0.2～0.4m arg(l-精氨酸)、0.5～2.5mm gsh/gssg(还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽)和0.5～1.5mm dtt(二硫苏糖醇)。

45、在一些方式中，步骤(5)所述的复性液为：50mm tris、0.5m nacl、0.3m arg、2mm/1mm gsh/gssg和1mm dtt，ph8.0。经过研究证明，从蛋白得率和蛋白反应性两个方面综合考虑，针对人白细胞介素-5重组蛋白，所述复性液相比其他ph条件下的复性液更优。

46、本发明经研究证明，选择ph 8.0的tris缓冲体系制备复性液，并在tris缓冲体系中添加nacl和arg，制备的人白细胞介素-5重组蛋白的蛋白反应性更高，蛋白得率也更高。

47、进一步地，步骤(5)所述透析的透析液包括tris、nacl和精氨酸。

48、在一些方式中，步骤(5)所述的低温条件为0-4℃。

49、在一些方式中，步骤(5)所述的浓缩条件为3kda超滤管4℃、5000g或peg6000包埋4℃过夜。

50、在一些方式中，步骤(5)所述透析液包括40～60mm tris、0.4～0.6m nacl、0～0.2arg，ph7.5～8.5。

51、在一些方式中，步骤(5)所述透析液为ph8.0、50mm tris、0.5m nacl、0.2m/0.1m/0marg。所述透析液能够保证所述目的蛋白在透析过程中保证人白细胞介素-5重组蛋白的稳定性，减少沉淀析出，提高人白细胞介素-5重组蛋白的收率。

52、再一方面，本发明提供了一种核酸分子在制备高活性的人白细胞介素-5重组蛋白上的用途，所述核酸分子包括重复两次的ala45-cys63、ser75-thr82、lys103-arg110和val124-ser134序列，所述ala45-cys63、ser75-thr82、lys103-arg110和val124-ser134分别具有如seq id no:1～4所示的核苷酸序列。

53、再一方面，本发明提供了一种人白细胞介素-5重组蛋白在人白细胞介素-5进行定量检测中的用途。

54、进一步地，所述人白细胞介素-5进行定量检测，可用于炎症或过敏性疾病的诊断和急性排斥反应或肿瘤的治疗预后。

55、本发明的有益效果：

56、1、提供了一种使用原核表达系统快速、经济、有效的制备高效反应性的人白细胞介素-5重组蛋白的方法；

57、2、根据人白细胞介素-5的mrna序列，选取除信号肽以外的ile20-ser134序列，基于疏水性、蛋白二级结构、抗原决定簇等参数，对人白细胞介素-5的抗原表位进行预测，选取4段(ala45-cys63，ser75-thr82，lys103-arg110，val124-ser134)可能形成抗原表位的序列进行连续表达并使用柔性连接肽重复表达两次，得到编码人白细胞介素-5重组蛋白抗原表位的核酸分子；

58、2、将所述核酸分子经人工合成后克隆至大肠杆菌表达载体得到重组载体，转染至大肠杆菌表达系统中，实现了人白细胞介素-5重组蛋白的高效表达，目的蛋白占总蛋白比例为40％-50％，并对其变性清洗和复性等条件进行了优化和调整，100ml菌液可获得1.3mg有高活性的人白细胞介素-5重组蛋白，在同样的蛋白浓度条件下其抗原反应性优于表达完整序列的人白细胞介素-5重组蛋白；

59、3、仅需一步纯化就能获得纯度大于95％的高纯度人白细胞介素-5重组蛋白；

60、4、制备方法步骤简单、成本低、回收率较高、抗原反应性强的特点，对炎症或过敏性疾病的诊断和急性排斥反应或肿瘤的治疗预后以及对人白细胞介素-5进行定量检测具有重要意义和广泛前景，可用于制备标准品，也可用作免疫动物制备抗体的抗原。