一种还原胺化酶在不对称合成手性胺中的应用

本发明涉及酶工程，尤其是指一种还原胺化酶在不对称合成手性胺中的应用。

背景技术：

1、手性胺是一类非常重要的手性合成砌块和手性拆分试剂，广泛用于天然产物、医药、农药、香精香料等精细化学品的合成.比如用于合成抗过敏药-左旋西替利嗪(适用范围最广、起效剂量低、可用于孕妇)，用于治疗阿尔兹海默症药-卡巴拉汀，抗消炎药物-加雷沙星，抗毒蕈碱类泌尿解痉药-素立芬新，抗心律失常和抗肿瘤药物等

2、目前合成手性胺的方法主要有物理和化学合成方法，但是这些方法存在反应条件苛刻反应时间长，危害环境、产品光学纯度低等问题。而生物催化技术具有环境友好、催化效率高、选择性好等绿色生物制造的典型特征，已发展成为医药化工领域替代或拓展传统化学合成的首要选择。目前已经建立的生物催化法合成手性胺的工艺主要有利用氧化酶氧化拆分(理论收率50％)，转胺酶催化转胺反应(原子利用率低、限于合成伯胺)，以及氨脱氢酶催化还原胺化(催化效率低)。

3、近年来报道了一种还原胺化酶(redams)，它是一类nadph依赖性的氧化还原酶，是亚胺还原酶的一个子类，还原胺化酶可以催化潜手性酮或醛与游离胺或者有机胺形成亚胺中间体，进而将其还原成高对映选择性的手性胺，具有100％理论转化率、立体选择性高。手性胺中间体的绿色高效生物合成已成为全球各大医药化工企业战略争夺的热点，而还原胺化酶催化的不对称还原胺化被认为最理想的手性胺合成途径。

4、2017年，turnernj教授发现了来源于米曲霉的nadph依赖型还原胺化酶(aspredam，登录号q2tw47)，采用该酶的q240a突变体，实现了雷沙吉兰手性中间体的克级制备，总转化数为32000，时空产率为3.73g·l–1·d–1。2021年，辉瑞公司利用工程酶spredam成功地实现了jak1抑制剂阿布西替尼中间体商业化规模制备，时空产率高达60g·l–1·d–1，dr>99:1，ee>99％。2022年，天津工生所孙周通等基于亚胺还原酶的晶体结构对ir-g36进行设计改造，实现烷基化氮杂环手性胺的高效合成，在24.9·g·l–1底物浓度下，转化率达到97％。时空产率达到35.5g·l–1·d–1。同年，王斌贵、高书山、崔成森研究员团队合作，利用ir-g02催化苯丙醛与1-萘乙胺外消旋体进行还原胺化制备级反应，通过动力学拆分合成西那卡塞类似物，转化率达到48％，ee>99％，时空产率高达18.1g·l–1·d–1。2023年，许建和团队报道了一种pcired可催化一系列羰基化合物和广泛的具有大位阻胺类亲核物的还原偶联，实现了制备级生物催化合成西那卡塞。

5、上述报道显示还原胺化酶是制备n-取代-α/δ-氨基酯和γ-内酰胺的有效催化剂。然而，利用还原胺化酶对n-取代β-氨基酯的合成目前仅有少量文献报道且具有较低的非对映体选择性。n-取代的β-氨基酯衍生物是合成抗真菌药物和生物碱的重要手性合成砌块，具有重要的药用价值。由于酮烯醇互变异构，β-酮酯的α位置在含水介质中容易外消旋，还原胺化酶可以通过动态动力学拆分(dkr)催化β-酮酯与不同胺供体实现n-取代β-氨基酯的合成，可实现100％的理论转化率。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种还原胺化酶在不对称合成手性胺中的应用，具体为一种还原胺化酶在不对称合成n-取代β-氨基酯中的应用。本发明以β-酮酯类化合物为底物，以还原胺化酶为催化剂催化生成手性胺n-取代β-氨基酯，可实现高效转化。

2、本发明通过以下技术方案实现：

3、本发明第一个目的是提供一种还原胺化酶在不对称合成手性胺中的应用，所述还原胺化酶的氨基酸序列如seq id no.2所示。

4、在本发明的一个实施例中，所述还原胺化酶来源于streptomycesviridochromogenes。

5、在本发明的一个实施例中，所述手性胺为n-取代β-氨基酯；所述n-取代β-氨基酯为(1r，2s)-2-(环丙氨基)环己烷-1-羧酸乙酯、(1r，2s)-2-(环丙氨基)环戊烷-1-羧酸乙酯，s-3-(环丙氨基)丁酸乙酯和s-3-(环丙基氨基)-4-苯基丁酸乙酯中的一种或多种。

6、在本发明的一个实施例中，所述应用的方法是以β-酮酯类化合物为底物，以还原胺化酶为催化剂催化生成手性胺。

7、在本发明的一个实施例中，所述β-酮酯类化合物为环己酮甲酸乙酯、环戊酮甲酸乙酯、乙酰乙酸乙酯和3氧-4-苯基丁酸乙酯中的一种或多种。

8、在本发明的一个实施例中，所述β-酮酯类化合物的添加量为10mmo1/l～200mmo1/l。

9、在本发明的一个实施例中，所述还原胺化酶的添加量为1ku/l～10ku/l。

10、在本发明的一个实施例中，所述应用的方法是在ph值为7-8.5(优选为7.5)的缓冲液中，在胺基供体和nadp+存在的条件下催化底物β-酮酯类化合物合成手性胺。

11、在本发明的一个实施例中，所述胺基供体为环丙胺、炔丙胺、烯丙胺和丙胺中的一种或多种。

12、在本发明的一个实施例中，所述nadp+的添加量为0.1mmol/l～1.0mmol/l。

13、在本发明的一个实施例中，所述催化的条件为：20℃-35℃反应6h-120h。

14、在本发明的一个实施例中，编码所述的还原胺化酶的基因的核苷酸序列如seq idno.1所示。所述的还原胺化酶的编码基因来源于链霉菌属(streptomycesviridochromogenes)，命名为svra34，基因全长903bp，其编码碱基序列(cds)从第一个碱基起至第903个碱基止，起始密码子为atg，终止密码子为tga，序列内无内含子。

15、在本发明的一个实施例中，本发明所述还原胺化酶的制备方法为该领域常规制备方法。所述制备方法较佳为:将编码所述还原胺化酶并带有点突变的核酸分子克隆到重组载体中，将所得的重组载体转化到转化体中，得到重组表达转化体，通过培养所得重组表达转化体，经镍柱亲和层析分离纯化获得所述蛋白。

16、在本发明的一个实施例中，携带所述还原胺化酶基因的表达载体可通过本领域常规方法将上述还原胺化酶基因克隆到各种表达载体上构建而成。所述的表达载体较佳地包括本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，所述载体优选地为pet28a质粒。

17、本发明提供一种表达所述的还原胺化酶的重组菌。重组菌是通过将上述表达载体转化至宿主细胞中制备得到，宿主细胞为本领域常规的宿主细胞，只要能满足重组表达载体可稳定的自行复制，并且其所携带的还原胺化酶基因可被有效表达即可。所述宿主细胞优选为大肠杆菌，更优选地为：大肠埃希氏菌e.coli bl21(de3)或大肠埃希氏菌e.colidh5α。

18、本发明提供一种利用所述的重组菌制备还原胺化酶的方法，包括如下步骤：将所述的重组细胞接种至含有卡那霉素的lb培养基中，37℃，150rpm～200rpm培养，培养液的吸光密度od600达到0.6～0.8，加入终浓度为0.2mm的异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷进行诱导，诱导温度为16℃，诱导12小时-18小时得到还原胺化酶。

19、在本发明的一个实施例中，所述nadph采用葡萄糖脱氢酶和葡萄糖反应提供，葡萄糖脱氢酶的用量为1ku/l～10ku/l；葡萄糖的用量为50mmol/l～400mmol/l。

20、本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

21、本发明提供的还原胺化酶svra34具有表达水平高、酶活力高等优点,可用于高效制备(1r，2s)-2-(环丙氨基)环己烷-1-羧酸乙酯等目前生物催化难以制备的手性胺n-取代β-氨基酯，经济性高，制备方法简单，反应条件温和，低耗能，对环境友好，副反应少，只需一步还原即可完成。因此，本发明所述还原胺化酶及其基因具有很好的工业应用开发前景。