一种提高质体介导RNA干扰抗棉铃虫的方法

本发明属于植物基因工程，涉及一种提高质体介导rna干扰抗棉铃虫的方法。

背景技术：

1、棉铃虫(helicoverpa armigera)一种广泛分布于世界各地的重要鳞翅目害虫。它是多食性害虫，危害包括棉花、番茄、大豆、玉米等农作物在内的200余种植物。棉铃虫的防治策略主要分为物理防治、化学防治、生物防治等几种。物理防治耗时耗力，面对大规模的虫害没有太大的效果。而多年以来使用化学农药防治棉铃虫受到广大的农业从事人员的青睐，主要是因为使用化学农药便于操作、杀灭速度快，但会产生抗药性并造成污染。转基因棉花，如表达苏云金芽孢杆菌毒蛋白(bacillus thuringiensis,bt)的转基因抗虫棉是一个很好的例子。目前，关于苏云金芽孢杆菌毒蛋白毒性机理提出两种模型，第一种是bt蛋白造成细胞膜上产生孔隙引起渗透失衡，第二种是引起细胞粒子通道的打开从而激活细胞死亡。为了防治棉铃虫，我国早在1997年就开始大规模推广转bt棉花。通过对中国上世纪到本世纪十年间的种群活动进行分析，发现转基因棉花使得虫害的发生率在其他作物中明显降低。然而，抗虫棉的推广，随之也带来了一些新的问题：(1)棉铃虫的进化对抗虫棉的抗性增强；(2)因棉盲蝽耐受bt毒蛋白，种群数量增加，从而变为主要的田间害虫；(3)在bt作物中，bt蛋白水平会随着温度升高、盐度升高、干旱和二氧化碳浓度升高而下降。这些出现的问题令人们探求新的防治策略。rna干扰(rnainterference,rnai)是一种潜在的具有巨大应用潜力的一种新方法，值得大力发展。

2、rnai是指在真核生物中，由内源或外源双链rna(dsrna)诱发的mrna降解，导致特异性阻碍靶标基因表达的现象。rnai抗虫技术是通过抑制害虫必需基因的表达，从而降低害虫的适应度或致死害虫。该技术因其靶标基因选择灵活、专一性强、对人畜无任何毒害、不易使昆虫产生抗性、对昆虫天敌和其他微生物无副作用等优点，具有较大的应用潜力。通过植物介导的rnai来治理害虫是一种新颖、直接而有效的方法，其工作原理是利用表达了害虫靶标基因dsrna的寄主植物喂食该昆虫，可以沉默昆虫特定靶标基因的表达，引起昆虫生长发育的异常，起到害虫防控的作用，而且对非靶标生物及环境友好。

3、对于鞘翅目昆虫来说，长的dsrna会比短的小干扰rna(sirna)诱导rnai反应的效果更好。与细胞核转化植物相比，由于质体中缺乏rnai通路，质体(叶绿体)转基因植物能积累更多dsrna。但是前期研究表明，sirna比长链dsrna能更有效地诱导棉铃虫的rnai效应，质体转基因植物抗棉铃虫的效果弱于核转化植株。

4、2007年，mao等首次将表达p450基因cyp6ae14的dsrna的拟南芥和烟草饲喂棉铃虫，该基因的表达被显著降低，而且棉铃虫对棉酚的耐受性大大减弱，并导致棉铃虫发育延迟。植保科技工作者通过在植物中表达其他不同的棉铃虫靶标基因的dsrna也实现了对棉铃虫的抗性。以几丁质酶基因为靶标构建表达其dsrna的转基因烟草和番茄，当棉铃虫幼虫取食了这两种转基因植物后，其靶标基因的转录水平减少了5.8～6.2倍，幼虫期延长了5～7天，虫体畸形率为38～41％，最终导致了52～56％的死亡率；ndufv2基因编码一个定位于线粒体的nadh脱氢酶黄素蛋白2，对于细胞能量代谢具有重要作用，表达dsndufv2的转基因棉花表现出较强的抗虫能力，取食的棉铃虫幼虫死亡率高达80％以上。

5、除了以上提到的细胞核转化植物，还可以通过在植物质体(叶绿体)中表达dsrna来防治害虫。由于质体基因组的拷贝数高且质体中缺乏rnai通路，dsrna不会被植物自身的dicer-like(dcl)蛋白降解成小干扰rna(sirna)，而能够在质体转基因植物体内大量积累。质体介导的rnai对鞘翅目昆虫马铃薯甲虫和二十八星瓢虫以及樱翅目昆虫西花蓟马的防治取得了非常好的防治效果。但是，鳞翅目昆虫中肠中的dsrnase活性较高，能更容易降解地dsrna而非sirna，导致表达dsrna的叶绿体转化植物抗棉铃虫的效果却弱于核转化植株。

6、因此，目前需要找到一种方法可以提高质体介导的rna干扰抗棉铃虫的方法。

技术实现思路

技术特征：

1.一种提高质体介导rna干扰抗棉铃虫的植物的制备方法，其特征在于：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，hpfc2是亚铁螯合酶2基因。

3.如权利要求1所述的抗棉铃虫的植物的制备方法制备的转基因植物在抵抗棉铃虫中的应用。

技术总结
本发明公开了一种提高质体介导RNA干扰抗棉铃虫的植物的制备方法，在现有的Nt‑pJZ43烟草植株中通过农杆菌介导的核转化，将hpFC2的表达盒质粒插入到烟草Nt‑pJZ43的核基因组中，得到超级转化植株Nt‑pJZ43‑pBP1，超级转化植株Nt‑pJZ43‑pBP1能够提高对棉铃虫的抗性。

技术研发人员：李圣纯,王家琦,陈楚铭,陈永博,陈博
受保护的技术使用者：湖北大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15