基于模型指导提高赤霉素GA3产量的方法及应用

本发明属于生物发酵，涉及提高赤霉素ga3产量的方法，具体地说是一种基于模型指导提高赤霉素ga3产量的方法及应用。

背景技术：

1、赤霉素是一种天然植物激素，但在植物、细菌和真菌中分离的赤霉素仅少数具有活性，其中，赤霉素ga3因其活性强，在调节植物休眠、促进茎和果实生长等方面具有广泛的应用前景而备受关注，具有良好的经济价值和社会效益，市场需求量大。

2、目前，赤霉素ga3的生产方法主要有植物提取法、化学合成法和微生物发酵法。然而，植物提取法和化学合成法均存在产量低、成本高、产生污染废弃物多等问题，虽然微生物发酵法是目前更节约和绿色的方法，但传统的微生物发酵法操作繁琐、发酵耗时长，且发酵生产赤霉素ga3的优势菌株，如藤仓赤霉菌，存在代谢网络复杂、部分参与代谢的关键基因未被发现等问题，导致直接利用藤仓赤霉菌发酵的代谢产物产量较低，极大限制各种代谢产物的产业化。因此，需要系统地探究藤仓赤霉菌的生理代谢特性，为发酵条件的优化和提高代谢物产量提供依据。

3、在探究藤仓赤霉菌的生理代谢特性过程中，采用传统正交试验方法存在周期长、成本高、存在不确定性和随机性的问题，随着生物信息学的发展，采用基因组规模代谢网络模型，有助于加快研究的进程和提高研究效率，但目前的基因组规模代谢在谷氨酸棒杆菌等代谢网络较清晰的原核微生物中应用较多，对于代谢网络复杂、参与代谢的关键基因发现少的真菌，构建相关模型时存在代谢反应分区和细胞组分确定困难的问题，目前尚无藤仓赤霉菌相关模型。

技术实现思路

1、本发明的一个目的，是要提供一种基于模型指导提高赤霉素ga3产量的方法，该方法基于首次构建的藤仓赤霉菌基因组规模代谢网络模型，对藤仓赤霉菌发酵生产赤霉素ga3的发酵培养条件进行优化，对藤仓赤霉菌相关基因进行遗传改造，以解决传统正交试验方法周期长、成本高、存在不确定性和随机性的问题；

2、本发明另外的目的，是要提供上述方法在提高赤霉素ga3产量中的应用，利用藤仓赤霉菌基因组规模代谢网络模型，构建基因工程菌，达到显著提高赤霉素ga3产量的目的；

3、为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

4、一种基于模型指导提高赤霉素ga3产量的方法，包括依次进行的以下步骤：

5、1)构建藤仓赤霉菌基因组规模代谢网络模型

6、获取基因组规模代谢网络模型所需的代谢反应数据及基因组数据，构建藤仓赤霉菌基因组规模代谢网络粗模型，通过底物吸收速率和碳氮源的利用率，提高藤仓赤霉菌基因组规模代谢网络粗模型的准确性，得到藤仓赤霉菌基因组规模代谢网络模型，标记为icy1235；

7、本发明中，藤仓赤霉菌蛋白质组为藤仓赤霉菌cbs 195.34(蛋白质组数据来自uniprot数据库)，拉丁名为fusarium fujikuroi cbs 195.34。

8、2)获得藤仓赤霉菌的优化培养条件与遗传改造靶点

9、利用藤仓赤霉菌基因组规模代谢网络模型，模拟藤仓赤霉菌的发酵培养，获得藤仓赤霉菌的优化培养条件；

10、利用藤仓赤霉菌基因组规模代谢网络模型，模拟藤仓赤霉菌的赤霉素ga3合成反应，利用optforce算法预测得遗传改造靶点；

11、3)发酵生产赤霉素ga3

12、利用优化培养条件发酵培养藤仓赤霉菌，生产赤霉素ga3；

13、和/或将过表达遗传改造靶点的藤仓赤霉菌工程菌用于发酵培养，生产赤霉素ga3。

14、作为本发明的进一步限定，所述培养用到的培养基中碳源除了葡萄糖、还可以为淀粉、甘露醇、蔗糖、甘油或果糖。

15、作为本发明的一种限定，所述藤仓赤霉菌基因组规模代谢网络模型的分区为细胞膜区(c)、线粒体区(m)、过氧化物酶体区(p)和细胞外区(e)。

16、作为本发明的进一步限定，所述优化培养条件为：将藤仓赤霉菌接入种子培养基，于28℃且200rpm条件下种子培养2天，得发酵液；

17、将发酵液以10v/v％的接种量接入发酵培养基，于28℃且200rpm条件下，控制氧气吸收速率为3-7mmol·gdw-1·h-1，发酵培养8天。

18、作为本发明的再进一步限定，所述种子培养基的组分包括：60g/l葡萄糖，5.5g/l酵母粉，0.2g/l mgso4·7h2o，1.5g/l kh2po4；

19、所述发酵培养基的组分包括：90g/l甘露醇，12g/l脱脂豆粕，0.1g/lmgso4·7h2o，1.5g/l kh2po4。

20、作为本发明的另一种限定，遗传改造靶点是ffuj_02053基因(acetyl-coenzyme asynthetase,ec 6.2.1.1)或ffuj_14337(p450-3，ec 1.-.-.-)基因

21、本发明还提供了上述基于模型指导提高赤霉素ga3产量的方法在构建高产赤霉素ga3的藤仓赤霉菌工程菌中的应用，所述藤仓赤霉菌工程菌使遗传改造靶点在藤仓赤霉菌中过表达。

22、作为本发明的一种限定，通过引物扩增ffuj_02053基因或ffuj_14337基因至puc-ffucas9-htbnls-hph-bik5-gt质粒骨架，构建重组质粒后，经转化，制得所述藤仓赤霉菌工程菌。

23、作为本发明的再进一步限定，所述ffuj_02053基因的引物序列为：

24、ffuj_02053-pcr-f:

25、taccccgcttgagcagacatcaccatgcgtcaacccatatcgacacagcc；

26、ffuj_02053-pcr-r:

27、tcatttcagaaataagttgcgcaatctgttctatcaggttttgtca；

28、所述ffuj_14337基因的引物序列为：

29、ffuj_14337-pcr-f:

30、gctaccccgcttgagcagacatcaccatgagtaattttgtgacgttgattga；

31、ffuj_14337-pcr-r:

32、tcatttcagaaataagttgctcatctccttcgcatctcaaga。

33、由于采用上述技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：

34、本发明的基于模型指导提高赤霉素ga3产量的方法，首次构建了藤仓赤霉菌的基因组规模代谢网络模型icy1235，该模型包含1752个反应，1979个代谢物和1235个基因，且细胞分区全面，对细胞质基质、细胞核、细胞质膜、高尔基体、溶酶体、细胞骨架和内质网均进行细致分区，填补了藤仓赤霉菌在基因组规模代谢网络模型上的空白；

35、模型中全面的反应通路为优化培养条件和确定代谢反应中的遗传改造靶点提供数据支撑，通过模型模拟、分析和实验验证，确定甘露醇是藤仓赤霉菌生长的优势碳源，最优摇瓶发酵转速为200rpm，同时确定上调基因为ffuj_02053(acetyl-coenzyme asynthetase,ec 6.2.1.1)和ffuj_14337(p450-3，ec 1.-.-.-)；

36、应用本发明的基于模型指导提高赤霉素ga3产量的方法构建工程菌，将遗传改造靶点在藤仓赤霉菌基因组中过表达，能使赤霉素ga3产量分别增加37.5％和75.0％。

37、本发明的基于模型指导提高赤霉素ga3产量的方法，通过模型模拟和预测藤仓赤霉菌的发酵培养和赤霉素ga3合成反应，获得优化培养条件和遗传改造靶点，用于优化赤霉素ga3的发酵生产，大大缩短了发酵时间，节约了发酵成本，减少实验误差，提高了实验精度。

38、下面结合附图和具体实施例对本发明作详细说明。