一种CAR-T细胞及其构建方法和应用与流程

本技术涉及细胞生物，尤其是涉及一种car-t细胞及其构建方法和应用。

背景技术：

1、随着肿瘤免疫疗法的兴起，采用“工程化”的嵌合抗原受体t细胞(chimericantigen receptor t cell,car-t)疗法特异性靶向肿瘤细胞进行肿瘤杀伤的技术已经取得了较大的进展。car-t疗法在血液恶性肿瘤的治疗中取得了显著的效果。在实体瘤的治疗中也取得了一定的突破，但由于实体瘤存在的多种抑制因素以及car-t本身存在的如细胞因子风暴等副作用均大大限制了car-t疗法对实体瘤的治疗效果及应用。特异性肿瘤抗原的缺乏成为限制car-t疗法进一步发展的重要因素。因此克服实体瘤复杂的微环境以及寻找特异性的肿瘤抗原及靶标至关重要。

2、肺癌的治疗仍以常规的手术为主，辅以放化疗，近些年兴起的免疫治疗以及靶向治疗也为肺癌的治愈带来了曙光。尽管针对肺癌的各种新药物、新方法层出不穷，但是切实有效的仍然不多，而针对car-t肿瘤疗法的广泛研究有望为肺癌治疗带来新的希望。在目前针对肺癌的car-t疗法中，多数由于肺癌没有显著特异的抗原降低了car-t细胞的靶向性，同时由于实体瘤存在复杂的环境，多数car-t细胞难以进入肿瘤内发挥作用。因此，寻找特异性的肺癌抗原来“武装”t细胞，同时增加car-t细胞的肿瘤浸润以及活性对肺癌的治疗至关重要。

3、随着car-t肿瘤免疫疗法研究如火如荼的开展，目前car-t细胞疗法已经更新至第五代。car-t细胞在构建时，需要对t细胞修饰的复杂程度和car-t实际应用中发挥功能进行综合考虑。根据临床试验显示，第二代和第三代car-t具有较稳定和较高效的作用。目前关于肺癌的car-t疗法，有多项临床前和临床试验获批开展中。但由于实体瘤存在多种抑制因素导致car-t的治疗疗效远未达到预期，如实体瘤的存在的免疫抑制微环境，使得t细胞进入肿瘤微环境后杀伤能力被抑制同时也无法持续性发挥作用、在肿瘤发生发展中，抗原逃逸现象使得car-t的靶向能力减弱，肿瘤杀伤作用降低、肿瘤相关成纤维细胞的存在等液大大限制car-t细胞的实体瘤浸润等。目前car-t治疗非小细胞肺癌的临床前研究和临床试验虽然层出不穷，但是针对实体瘤的car-t细胞治疗效果仍十分有限，缺乏攻克肺癌组织里既有细胞外基质又含有肿瘤相关成纤维细胞的特殊物理屏障的有效且具备特异性的靶点。因此，打破实体瘤免疫抑制微环境，寻找特异性肿瘤抗原作为car-t肿瘤治疗靶点是目前亟需解决的科学难题。

4、水通道蛋白3(aqp3)的作用是重吸收水和甘油，位置分布在肾脏髓质集合管的底外侧细胞膜。aqp3可通过水和甘油运输形成伪足而促进细胞的迁移,并通过维持细胞内高水平的甘油以生成atp和脂类，从而导致细胞增殖。多项研究表明，上调aqp3的表达，可促进肿瘤的发生。据报道，aqp3在肺腺癌中高表达，并且和预后密切相关，可通过介导活性氧的跨膜转运调控肺癌细胞的自噬从而影响肺癌的进程。同时，aqp3在诸如乳腺癌，肾癌以及胃肠肿瘤中亦存在高表达的现象。因此针对这一靶点，有望解决更为广泛的肿瘤类型。目前未见将aqp3作为肿瘤新靶点用于肿瘤免疫治疗的研究。

技术实现思路

1、本技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种car-t细胞及其构建方法和应用，本技术通过寻找高亲和力的aqp3抗体作为car-t的胞外识别区域，构建了第二代car-t系统，将其用于肺癌的治疗研究。aqp3高表达于肺癌细胞表面和基质细胞且调控细胞的水和甘油转运，以此为靶点可以通过瓦解肿瘤的屏障的同时杀伤肿瘤细胞，从而增加car-t细胞的疗效。

2、为实现上述目的，本技术采取的技术方案为：

3、第一目的，本技术提供了一种嵌合抗原受体融合蛋白，所述融合蛋白从n-末端到c-末端包含：

4、(i)包含单链可变片段scfv，其中scfv针对aqp3肿瘤抗原，所述scfv氨基酸序列如seq id no：1所示，

5、(ii)铰链区，

6、(iii)跨膜区，

7、(iv)胞内刺激信号区。

8、本技术创新性地利用aqp3作为全新抗癌靶点，aqp3不仅在肿瘤细胞中高表达，在肿瘤基质细胞亦高表达，同时介导水和甘油的转运，可能有助于打破肿瘤存在的物理屏障，对肿瘤进行杀伤。本技术制备的嵌合抗原受体融合蛋白可应用于治疗aqp3阳性的恶性肿瘤，特别是在治疗非小细胞肺癌中的应用效果显著，并且治疗肺癌过程中对正常的组织损伤较小，安全性较高。

9、作为本技术所述嵌合抗原受体融合蛋白的优选实施方式，所述铰链区为cd8α铰链区；所述跨膜区为cd8α跨膜区；所述胞内刺激信号区为4-1bb-cd3ζ。

10、作为本技术所述嵌合抗原受体融合蛋白的优选实施方式，所述胞外识别区的氨基酸序列如seq id no：3所示。

11、作为本技术所述嵌合抗原受体融合蛋白的优选实施方式，所述嵌合抗原受体融合蛋白的核苷酸序列如seq id no：2所示；所述嵌合抗原受体融合蛋白的氨基酸序列如seqid no：4所示。

12、第二目的，本技术提供了一种编码所述的嵌合抗原受体融合蛋白的核酸分子。

13、第三目的，本技术提供了一种载体，所述的载体含有上述核酸分子。

14、作为本技术所述载体的优选实施方式，所述载体选自dna、rna、质粒、慢病毒载体或其组合，优选地，所述载体为慢病毒载体。所述载体还可以为本领域中常规使用的载体，只要能实现本技术的技术效果即可。

15、作为本技术所述载体的优选实施方式，核苷酸序列如seq id no：2所示的嵌合抗原受体融合蛋白通过同源重组方式连接于慢病毒载体上。

16、第四目的，本技术提供了一种表达上述嵌合抗原受体融合蛋白的car-t细胞(即aqp3-car-t细胞)。

17、所述car-t细胞中car分子包括依次串联的胞外识别区、铰链区、跨膜区和胞内刺激信号域，所述的胞外识别区为aqp3蛋白结合位点，胞内刺激信号域为4-1bb，构建得到的car-t细胞在体内外可以显著杀伤肺癌细胞，可以治疗aqp3阳性的恶性肿瘤，特别是在治疗非小细胞肺癌中的应用效果显著，同时所述car-t细胞治疗肺癌过程中对正常的组织损伤较小，安全性较高，值得进一步研究和推广。

18、本技术所述的car-t细胞治疗的胞外识别区利用了非小细胞肺癌特异性抗原aqp3作为肿瘤免疫治疗靶点，并且胞外识别区选用了与aqp3具有高亲和力的抗体。aqp3不仅在肺癌组织的肿瘤细胞上表达同时也表达在非肿瘤细胞的肿瘤基质细胞等成分上，介导水分和甘油转运，可能促使car-t细胞更好地浸润进肿瘤中，该靶点与目前car-t治疗肺癌的靶点而言，具有更加有效的理论基础。

19、第五目的，本技术提供了一种表达上述嵌合抗原受体融合蛋白的car-t细胞的构建方法，包括以下步骤：将所述的核酸分子或所述的载体转导入t细胞内，从而获得所述car-t细胞，所述car-t细胞的胞外识别区为aqp3蛋白结合位点。

20、car-t细胞的构建方法，具体步骤为：

21、i、构建嵌合抗原受体融合蛋白：依次连接cd8α的信号肽、胞外识别区(包含单链可变片段scfv，其中scfv针对aqp3肿瘤抗原，所述scfv氨基酸序列如seq id no：1所示)、cd8α胞外区、cd8α的跨膜区，得到的嵌合抗原受体融合蛋白；所述嵌合抗原受体融合蛋白的核苷酸序列如seq id no：2所示；所述嵌合抗原受体融合蛋白的氨基酸序列如seq id no：4所示。

22、ii、构建慢病毒载体和包装慢病毒：将上述的嵌合抗原受体融合蛋白通过同源重组方式连接于慢病毒载体上，经过二代测序确定过表达片段的准确性。然后通过质粒中提纯化后，将质粒与慢病毒包装质粒按比例转染293ft细胞，72小时后收集上清经浓缩后获取病毒液，最后检测滴度后保存于-80℃超低温冰箱。

23、iii、t细胞的分离和扩增培养：收集健康成年人外周静脉血，利用ficoll分离法获取pbmc，再经过cd3阳性磁珠从中分离出t细胞进行扩增培养；采用步骤ii中制得的慢病毒对上述培养得到的t细胞进行转染并扩增培养，获得aqp3-car-t细胞。

24、第六目的，本技术提供了一种上述的嵌合抗原受体融合蛋白、核酸分子、所述的载体、car-t细胞的用途，用于制备预防和/或治疗肿瘤药物或制剂。

25、本技术制备的嵌合抗原受体融合蛋白、car-t细胞可以应用于治疗aqp3阳性的恶性肿瘤，特别是在治疗非小细胞肺癌中的应用效果显著。在体内外实验中，本技术制备的car-t细胞(即aqp3-car-t细胞)可以显著杀伤肺癌细胞，为非小细胞肺癌的治疗提供了新的靶标。同时aqp3-car-t治疗肺癌过程中对正常的组织损伤较小，安全性较高，值得进一步研究和推广。

26、作为本技术所述用途的优选实施方式，所述肿瘤为aqp3阳性的恶性肿瘤。

27、作为本技术所述用途的优选实施方式，所述aqp3阳性的恶性肿瘤为非小细胞肺癌。

28、作为本技术所述用途的优选实施方式，所述aqp3阳性的恶性肿瘤包括非小细胞肺癌系h460和a549。

29、在体外实验中，本技术构建的car-t细胞也展示了有效的治疗作用，car-t治疗aqp3高表达的肺癌细胞系h460，可见在normal t无明显作用下，car-t展现出强劲的杀伤肿瘤细胞的作用。在t细胞和肿瘤细胞共孵育一定时间后，ifn-γ的分泌与t细胞的杀伤能力是呈正比的对应关系，在aqp3 car-t杀伤h460细胞组的分泌量明显高于其他组，具有显著性差异。同时在体内实验中，aqp3 car-t细胞可显著杀伤肺癌h460形成的皮下移植瘤。病理切片显示car-t细胞治疗组肿瘤组织出现明显的大面积细胞坏死等。

30、本技术还提供了一种制剂，所述制剂含有本技术第一目的所述的嵌合抗原受体融合蛋白、本技术第二目的所述的核酸分子、本技术第三目的所述的载体、或本技术第四目的所述的car-t细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

31、在另一优选例中，所述制剂为液态制剂。

32、在另一优选例中，所述制剂的剂型为注射剂。

33、在另一优选例中，所述制剂中所述car-t细胞的浓度为1×103-1×108个细胞/ml，较佳地1×107个细胞/ml。

34、与现有技术相比，本技术具有以下有益效果：

35、本技术创新性地利用aqp3作为全新抗癌靶点，aqp3不仅在肿瘤细胞中高表达，在肿瘤基质细胞亦高表达，同时介导水和甘油的转运，可能有助于打破肿瘤存在的物理屏障，促使car-t细胞更好地浸润进肿瘤中，对肿瘤进行杀伤。本技术制备的嵌合抗原受体融合蛋白可应用于治疗aqp3阳性的恶性肿瘤，特别是在治疗非小细胞肺癌中的应用效果显著，并且治疗肺癌过程中对正常的组织损伤较小，安全性较高。

36、在肺癌中，aqp3高表达于肿瘤细胞表面。选择aqp3作为car-t治疗的靶点，弥补了car-t治疗非小细胞肺癌缺乏有效特异性靶点、car-t难以克服肿瘤基质细胞屏障的缺点，并且还能抑制aqp3发挥促进肿瘤进展的作用，是一个具备多项优点的治疗方向。

37、本技术的aqp3-car-t细胞也给其他aqp3阳性的肿瘤类型带来了治疗的方向，在肺癌这aqp3高表达肿瘤上已经取得了体内外实验的有益结果，aqp3-car依赖aqp3表达而发挥作用的治疗机制具备广泛的应用价值。本技术弥补了肺癌治疗靶点单一的缺点，为肺癌治疗提供新的靶点和思路，值得进一步研究和推广。