月季RhMYB28在调控植物原花青素合成和增强植物抗逆性方面的应用

本发明涉及植物基因工程，具体涉及月季rhmyb28在调控植物原花青素合成和增强植物抗逆性方面的应用。

背景技术：

1、原花青素(proanthocyanidin，pa)，是一种有着特殊分子结构的类黄酮混合物(dixon ra，2005)，广泛存在于茎部、树皮、花、种子或果皮中(张印，2021)。原花青素的基础单元是黄烷-3-醇类化合物(张慧文等，2015)，根据黄烷-3-醇单元的类型可分为儿茶素(catechin)、表儿茶素(epicatechin)、表没食儿茶素(gallocatechin)、表阿夫儿茶素(epielechin)、阿夫儿茶素(afzelechin)和表没食儿(epigallocatechin)(lelono r a，2013；赵国玲等，2012)。根据单元之间的连接可分为通过c-c键和c-o-c键连接的a型(ma q，2014)和通过一个c-c键连接的b型(infante r，2011)。根据聚合复杂程度，通常将2-5个聚体称为低聚原花青素(opc)，也就是可溶性原花青素，而超过5个聚体则称为高聚原花青素(ppc)，简称不可溶性原花青素。根据羟基的修饰方式，有甲基化、酯化、糖基化等。正是这些特点才形成了结构性质多样的原花青素种类。

2、研究表明在生物胁迫和非生物胁迫中，原花青素含量的增加可以提高植物的抗逆性，在保护植物免受紫外线、捕食者觅食、微生物入侵等不利环境方面起着关键作用(dixonr a，2013；wang l j，2017)，另外，牧草中适度的原花青素含量可以防止潜在的动物胀气病，增强对牧草的消化(li y g，1996)，并提高过瘤胃蛋白的可利用性(naumann h d，2013)。对人类来说，原花青素是一种天然的抗氧化剂，对人体健康有益(santos-buelga c，2000)，自由基和氧化应激是导致心血管疾病的原因之一，而原花青素可以有效清除氧自由基，保持心脏功能，降低血液胆固醇和血糖水平，抵抗动脉粥样硬化等，通过一系列作用，达到预防心血管疾病、保护心血管系统的目的(zhao gaixia，2010；serra at，2012)。研究发现，绿茶提取液中富含pa(molan al，2009)，能够抗衰老、预防心血管疾病(dixon r a，2005)，葡萄籽中的原花青素对抗动脉粥样硬化和保护血管内皮细胞等有积极的作用(zhaog x，2010；马亚兵，2004；aldini g，2003)，随着研究的进一步深入，在黑莓、荔枝和落叶松等提取的原花青素都具有不同程度的抗氧化作用(徐怀德等，2008；王威等，2011；蒋其钟，2010)。此外，原花青素还可以决定植物及其衍生品的色素，味道，包括一些果实如柿子(salvador a，2007)、草莓(schaart j g，2013)、葡萄及其加工产品葡萄酒(bogs j，2017)；农作物的种皮颜色因为原花青素的积累而呈现深色，例如培育出的黄色油菜籽粒含油量高、种皮薄、加工方便(tang z l，2010)。目前，原花青素作为天然抗氧化剂、营养强化剂、dna保护剂等，广泛应用于药品、食品、化妆品等市场。

3、月季(rosa chinensis‘old blush’)是蔷薇科蔷薇属多年生落叶灌木，因其花期长、花色丰富、品质多样等特点，居于四大切花之首，具有悠久的种植历史，广泛用于园林造景上。除了作为园林观赏植物外，月季还具有一定的药用价值，其花瓣果实均含有丰富的原花青素，制成的花茶具有美容养颜的功效。色素作为人类膳食摄入的主要营养物质之一，而原花青素是一种天然的抗氧化物质，对于预防心血管疾病和延缓细胞衰老等发挥着重要的作用(heim k e，2002)。合理利用月季中的原花青素资源，研发出天然无害的功能食品、药品、化妆品等产品，拓宽市场。

技术实现思路

1、本发明的目的提供一种在月季中分离出的功能基因rhmyb28调控植物原花青素合成中的应用，而且该基因与植物抗逆性相关。所述的基因与植物原花青素合成有关。将该基因的完整翻译区与花椰菜花叶病毒启动子结合后直接转入一般植物体，转基因植株的原花青素含量显著增加，转基因植株的抗逆性能力明显增强。

2、本发明具体采用以下技术方案实现：

3、本发明提供了月季中表达rhmyb28的基因编码序列及其功能，具体包括：rhmyb28基因的核苷酸编码序列的克隆，表达载体构建，以及转化此基因于烟草内，进行分子鉴定和表型观察。

4、本发明首先从月季中克隆出rhmyb28功能基因。该基因片段为具有特定序列的dna分子，其开放阅读框为921bp，其核苷酸序列如序列表seq id n0：1所示。

5、本发明还提供了这种月季rhmyb28蛋白编码序列，它有306个氨基酸残基，其对应的氨基酸序列如seq id no:2所示。

6、本发明还提供了用于调取获得月季样品中基因rhmyb28的一对核苷酸引物。该引物根据基因rhmyb28设计，使用该对引物对月季花瓣样品cdna进行pcr扩增可获得921bp的基因片段。该引物对的dna序列如下所示：

7、p1正向引物:5’atgggtagaggtcctcggt3’(见序列表seq id no:3)

8、p2反向引物:5’tcaactcaacataacatttagatca3’(见序列表seq id no:4)

9、本发明还提供了一对检测月季rhmyb28基因在转基因烟草中表达的核苷酸引物。该引物根据基因rhmyb28设计，使用此对引物对转化该基因的烟草样品cdna进行rt-pcr扩增，检测该基因是否在转基因烟草中表达，可获得341bp的基因片段。该引物对的dna序列为：

10、p3正向引物:5’cttggtcaaggctgttaattctgtc 3’(见序列表seq id no:5)

11、p4反向引物:5’cattcccaagccaatcctcat 3’(见序列表seq id no:6)

12、可利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，通过直接dna转化、电导、农杆菌介导等常规生物技术方法将本发明提供的rhmyb28的编码基因导入植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。使用本发明的基因片段构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前面可加上任意一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或者植株进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入具有抗性的抗生素标记物(例如卡那霉素或潮霉素等)。被转化的宿主是包括烟草在内的多种植物，培育抗逆性显著增强的植物种类。

13、本发明还提供了一种转基因烟草原花青素提取方法。准确称取0.4g叶片和花瓣，加入3ml提取液(丙酮︰水︰冰醋酸＝70︰29.5︰0.5，体积比)于水浴条件下35℃超声1h，期间每隔20min用旋转振荡器振荡2min。12000rpm离心10min，取上清至新的离心管中，再分别用氯仿和正己烷抽提2次，然后用孔径0.45μm的尼龙微孔滤器过滤，保存于–40℃冰箱中，用于原花青素含量测定。