PSK3基因在促进紫花苜蓿遗传转化效率上的应用

本发明属于植物基因工程和基因编辑，特别涉及psk3基因在促进紫花苜蓿遗传转化效率上的应用。

背景技术：

1、紫花苜蓿被誉为“牧草之王”，是全世界种植面积最大的饲草作物。叶茎比是决定紫花苜蓿生物量、蛋白质含量等重要农艺性状的关键指标之一，培育叶片数较多的品种可提高苜蓿的叶茎比，从而提高苜蓿的生物量和营养价值。cys(2)his(2)锌指转录因子palmate-likepentafoliata1(palm1)参与苜蓿侧小叶的起始和叶片初级形态的建成，丧失功能的蒺藜苜蓿palm1突变体呈现裂叶表型，叶尖聚集有4-5个小叶，可显著增加苜蓿的叶茎比。

2、除利用常规育种技术进行苜蓿种质创新和育种外，生物技术也不断被引入苜蓿育种工作中，并取得了重要突破，其中基因编辑技术为培育优异苜蓿新种质提供了新的技术途径。然而，当前大部分植物的基因编辑需要依靠遗传转化技术才能实现，因此如何提高遗传转化效率成为制约植物基因编辑的瓶颈之一。紫花苜蓿愈伤发生和再生效率低下，导致其遗传转化体系对品种和基因型依赖严重。另外，紫花苜蓿遗传背景复杂，基因组庞大，同源多倍体基因组相似度高，导致基因编辑效率低甚至不编辑，载体构建复杂，严重阻碍了基因编辑技术在紫花苜蓿遗传育种中的推广和应用。

3、植物愈伤形成与再生在细胞水平主要涉及细胞命运的转变和细胞全能性的建立。该过程受一系列调控植物胚胎发育的核心转录因子的协同控制。异源过表达上述核心转录因子，例如babyboom-wus2、grf4-gif1、tawox5等，可作为分子辅助工具促进外植体的快速脱分化形成愈伤或加速愈伤再分化形成器官，从而显著降低了基因转化对外植体来源与基因型的要求。然而上述分子辅助工具无法同时实现愈伤快速增殖与高效再生，且很多分子辅助工具易致畸形，导致应用受限。psk3基因编码一种磺化五肽生长因子(磺肽素)，能够同时促进愈伤快速增殖与高效再生。然而，之前报道多为磺化五肽生长因子的外源施加，该物质未商业化，其施加量随植物物种及品种的不同而波动较大，不稳定且重复性差)，并且至今未见该基因在植物组培快繁与遗传转化方面的使用。因此本专利psk3同时促进紫花苜蓿愈伤增殖与再生，构建新的高效愈伤增殖与再生的遗传转化辅助分子工具，用于紫花苜蓿基因编辑和新种质的创制。

技术实现思路

1、本发明针对上述技术问题提供一种psk3基因在促进紫花苜蓿遗传转化效率上的应用，本发明载体是由一个组成型强启动子拟南芥ubiquitin10的强启动子同时启动cas9模块和sgrna模块协同高效表达从而达到高效编辑的效果，而trna串联系统(使用trna将多个sgrna串联表达)，可实现同一基因或不同基因多个靶位点的同时编辑。另本载体同时带有植物磺肽素编码基因phytosulfokine3precursor(psk3)和植物抗性筛选基因(hph/bar/nptⅱ)，其中psk3基因可显著促进苜蓿愈伤增殖和再生。

2、本发明是通过如下技术方案来实现的：

3、psk3基因在促进紫花苜蓿愈伤增殖和再生中的应用。

4、本发明还提供所述紫花苜蓿基因编辑载体系统的应用，所述系统编码相应psk3蛋白质，提高紫花苜蓿愈伤发生和再生效率，所述载体系统为psk3-crispr_2.0-prgeb31r，其中，cas9以及sgrna由拟南芥ubiquitin10的强启动子启动表达。

5、本发明还提供一种基因编辑载体系统psk3-crispr_2.0-prgeb31r-kopalm1，所述系统能用于mspalm1基因编辑。

6、进一步，所述基因编辑载体系统中的palm1基因为其它控制性状的基因。

7、本发明还提供利用psk3-crispr_2.0-prgeb31r基因编辑载体系统获得多叶型紫花苜蓿的方法，所述方法包括如下步骤：

8、(1)获取紫花苜蓿psk3基因序列，设计引物；

9、(2)根据已获得的psk3基因序列，设计引物如下：

10、psk3-f：catttcatttggagaggacaatgaggctaagttttatctt

11、psk3-r：tcaaggcttatgatgttgtg

12、(3)从peg100载体上扩增camv35spromoter序列，设计引物如下：

13、35s-psk3-f：tcccgccttcagttttgagacttttcaacaaagga

14、35s-psk3-r：tgtcctctccaaatgaaatga

15、(4)从peg100载体上扩增ocsterminator序列，设计引物如下：ocs-psk3-f：acatcataagccttgactgctttaatgagatatgcg ocs-psk3-r：aaacactgatagtttctgctgagcctcgacagtt

16、(5)使用高保真酶对psk3、camv35spromoter和ocsterminator3个片段进行pcr扩增，片段大小分别为369bp、346bp、708bp，以3个pcr反应产物为模板，进行二轮pcr反应，使用桥联方式把3个pcr反应产物连接成一个psk3完整表达盒，连接引物序列如下：

17、35s-psk3-f：tcccgccttcagttttgagacttttcaacaaagga ocs-psk3-r：aaacactgatagtttctgctgagcctcgacagtt

18、(6)使用pmeⅰ限制性内切酶对crispr_2.0-prgeb31r载体进行单酶切并割胶回收，将5)回收的目的片段通过无缝连接方式连入到酶切后的crispr_2.0-prgeb31r载体，连接反应产物转入dh5α，鉴定阳性克隆并测序，将测序结果和已经报道的序列比对，将测序正确的菌落培养后提取psk3-crispr_2.0-prgeb31r载体质粒并在-20℃保存；

19、(7)获取紫花苜蓿mspalm1基因序列，设计引物；

20、(8)根据已经获得的紫花苜蓿mspalm1基因序列，以及crispr(protospacer-adjacentmotif(pam)为ngg)载体设计原则，选取的四个靶位点分别为：

21、‘ggaatattatgaacacaaca’，‘cggtcagctcaagctcttgg’,‘ggaaacgagcacggtcgcgg’，‘tttaccatttcttccgtgtt’；

22、(9)选定靶位点后，使用高保真酶对含有靶位点、trna和sgrna片段进行pcr扩增；设计不同靶位点相应的引物，以包含trna和sgrna序列的pgtr载体为模板；pcr扩增并进行胶回收获得200bp的片段，然后取出pcr反应产物进行胶回收；引物序列如下：

23、mspalm1-trna-crisprcas92.0-1：

24、taggtctcaatcgaacaaagcaccagtg mspalm1-trna-crisprcas92.0-2：

25、gcggtctcatcataatattcctgcaccagccgggaa mspalm1-trna-crisprcas92.0-3：

26、taggtctcaatgaacacaacagttttagagctagaaa mspalm1-trna-crisprcas92.0-4：

27、gcggtctcattgagctgaccgtgcaccagccgggaa mspalm1-trna-crisprcas92.0-5：

28、taggtctcatcaagctcttgggttttagagctagaaa mspalm1-trna-crisprcas92.0-6：

29、gcggtctcagtgctcgtttcctgcaccagccgggaa mspalm1-trna-crisprcas92.0-7：

30、taggtctcagcacggtcgcgggttttagagctagaaa mspalm1-trna-crisprcas92.0-8：

31、gcggtctcaagaaatggtaaatgcaccagccgggaa mspalm1-trna-crisprcas92.0-9：

32、taggtctcattcttccgtgttgttttagagctagaaa mspalm1-trna-crisprcas92.0-10：

33、taggtctcaatataaaaaaagcaccgactcggtgcc；

34、(10)回收的目的片段使用bsaⅰ限制性内切酶和t4连接酶通过一步法连接反应连入psk3-crispr_2.0-prgeb31r骨架载体，连接反应产物转入dh5α，鉴定阳性克隆并测序，将测序结果和已经报道的序列对比，将测序正确的菌落培养后提取psk3-crispr_2.0-prgeb31r-kopalm1载体质粒并在-20℃保存。

35、(11)制备农杆菌侵染液，将紫花苜蓿叶子块浸泡在农杆菌侵染液中，诱导愈伤组织，长出的愈伤组织转移到分化培养基上诱导再生芽，再生芽转移到生根培养基诱导芽生根，已经生根的幼苗长到6-8cm高，转移到透气湿润的土里，待紫花苜蓿长出新叶。

36、进一步，所述步骤(8)crispr/cas9载体设计靶设计原则：靶位点20个碱基，并且须以-ngg-结尾；靶位点的gc含量应该介于40％到70％，并且避免具有连续4个t碱基；针对紫花苜蓿palm1基因设计2-4个靶位点，提高基因编辑的成功率。

37、进一步，所述步骤(2)(3)(4)(5)(9)pcr的反应体系为：25μlphanta(2×)，cdna，正/反向引物(10μm)各1μl，2μlpgtr载体，21μlddh2o；pcr反应条件为：95℃3min；95℃15s，56℃15s；72℃45s，34个循环；72℃10min。

38、进一步，所述的步骤(6)的连接反应体系：5×ceⅱbuffer4μl，expressⅱ2μl，载体300ng，目的胶回收片段60ng，去离子水补齐20μl反应总体系。连接pcr程序：37℃连接30min，程序结束后4℃保存于冰箱备用。

39、进一步，所述的步骤(10)的连接反应体系：bsaⅰ15u，10×basⅰbuffer1.5μl，t4连接酶50u，载体0.5μg，目的胶回收片段30ng，去离子水补齐15μl反应总体系；连接pcr程序：37℃酶切10min，10℃连接5min，20℃延伸10min，3个循环，37℃酶切10min，10℃连接5min，20℃延伸10min，10个循环，程序结束后4℃保存于冰箱备用。

40、进一步，所述步骤(10)将构建好的质粒加入融化的农杆菌感受态冰浴30min，后液氮速冻3min，37℃热激90s，冰浴2min，加入lb液体培养基，28℃摇床160rpm培养2-3h。

41、本发明与现有技术相比的有益效果：

42、本发明利用psk3基因能够同时促进紫花苜蓿愈伤增殖和再生的优势，结合psk3-crispr_2.0-prgeb31r基因编辑高效简捷载体系统，以公农1号紫花苜蓿为遗传背景，4-6个月内成功将紫花苜蓿palm1基因纯合编辑，并获得多叶型紫花苜蓿。经鉴定转基因阳性效率可达63％以上，其中79％的阳性转基因株系的palm1基因获得了编辑。