一种表达载体及其制备方法和应用

本发明涉及表达载体领域，具体涉及一种表达载体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、虾青素(3,3′-二羟基-β,β′-胡萝卜素-4,4′-二酮基)是类胡萝卜素的含氧衍生物，是一种红色的脂溶性酮类类胡萝卜素，属于叶黄素家族，其具有独特的抗氧化活性，通过接受或捐赠电子来中和自由基或其他氧化剂，而不会在这个过程中被破坏或成为助氧化剂。目前，虾青素的主要合成方法为通过微藻雨生红球藻生物天然合成和人工化学合成。雨生红球藻来源虾青素的立体异构体是天然形态(3s,3′s)，是最有价值的立体异构体。人工化学合成的虾青素，由立体异构体(3s,3′s)、(3r,3′s)和(3r,3′r)以1:2:1的比例组成，其抗氧化能力比雨生红球藻天然合成的虾青素低20倍。

2、为了开发一种高效、低成本的方法来生产具有高生物活性的虾青素，许多研究团队已经使用了植物，因为虾青素可以在植物质体中积累。但是，现有技术中在植物中通过基因工程生产虾青素，都是通过过表达一个或多个酶基因实现的，通过该方法生产出的虾青素含量较低。因此，有必要提供一种能够提高虾青素含量的方法。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中存在基因工程生物合成虾青素都是共表达一个或多个酶基因，而该方法合成的虾青素含量较低的问题，本发明提供一种表达载体及其制备方法和应用，可以共表达一个转录因子和两个酶基因，在转基因烟草叶片中生物合成了虾青素，并且合成了其他表达酶基因产生虾青素的叶片中无法合成的番茄红素。

2、为实现上述目的，本发明的技术方案如下。

3、一种表达载体，所述表达载体为pbi121-nttpcrbkt-nttphpbhy-csmads6；

4、所述表达载体构建过程为：合成nttpcrbkt基因，克隆在pbi121载体的smi和saci酶切位点上，得到pbi121-nttpcrbkt载体；

5、合成nttphpbhy基因，在pbi121-nttpcrbkt载体的hindiii位点插入ntt phpbhy基因，得到pbi121-nttpcrbkt-nttphpbhy载体；

6、合成csmads6基因，在pbi121-nttpcrbkt-nttphpbhy载体的hindiii位点插入csmads6基因，得到pbi121-nttpcrbkt-nttphpbhy-csmads6表达载体；

7、所述nttpcrbkt基因由莱茵衣藻的crbkt基因与烟草1,5-二磷酸核酮糖羧化酶小亚基的质体转运肽nttp合成得到的；所述nttphpbhy基因是由雨生红球藻的hpbhy基因与烟草1,5-二磷酸核酮糖羧化酶小亚基的质体转运肽nttp合成得到的；所述csmads6基因为化学合成柑橘的转录因子csmads6。

8、进一步地，所述crbkt基因ncbi基因号为ay860820，所述nttp基因ncbi基因号为mk070896.1；所述hpbhy基因ncbi基因号为af162276.1。

9、进一步地，所述nttpcrbkt基因如seq id no.59所示，其具体合成方法是以crbkt基因为模板，使用正向引物如seq id no.1所示和反向引物如seq id no.2所示进行pcr扩增，得到片段1并回收；以nttp基因为模板，使用正向引物如seq id no.3所示和反向引物如seq id no.4所示进行pcr扩增，得到片段2并回收；smai和saci双酶切pbi121载体，得到线性化载体；线性化载体、片段1和片段2通过无缝克隆连接得到pbi121-nttpcrbkt载体。

10、进一步地，所述nttphpbhy基因如seq id no.60所示，其具体合成方法是以hpbhy基因为模板，使用正向引物如seq id no.7所示和反向引物如se q id no.8所示进行pcr扩增，得到片段3并回收；以nttp基因为模板，使用正向引物如seq id no.5所示和反向引物如seq id no.6所示进行pcr扩增，得到片段4并回收，得到线性化载体；spei和bamhi双酶切psy06载体，线性化载体、片段3和片段4重组后连接得到psy06-nttphpbhy载体；以构建的psy06-bhy为模板，使用正向引物如seq id no.9所示和反向引物如seq id no.10所示扩增atubq10p-bhy-atubqter表达框，hindiii单酶切pbi121-nttpcrb kt载体，线性化载体和bhy表达框重组后获得pbi121-nttpcrbkt-nttphpbhy载体。

11、本发明还提供一种权利要求1所述的表达载体的制备方法，包括以下步骤：

12、s1、构建pbi121-nttpcrbkt载体：合成nttpcrbkt基因，并克隆在pbi121载体的smi和saci酶切位点上，得到pbi121-nttpcrbkt载体；

13、s2、构建pbi121-nttpcrbkt-nttphpbhy载体：合成nttphpbhy基因，并克隆在psy06载体的spei和bamhi酶切位点上，获得psy06-nttphpbhy载体，该psy06-nttphpbhy载体包括atubq10p-nttphpbhy-atubqter表达框，将atubq10p-nttphpbhy-atubqter表达框插入到pbi121-nttpcrbkt载体的hindi ii位点，得到pbi121-nttpcrbkt-nttphpbhy载体；

14、s3、构建pbi121-nttpcrbkt-nttphpbhy-csmads6载体：合成csmads6基因，并插入到super1300载体的xbai位点，得到super1300-csmads6载体，该载体包括masp-csmads6-noster表达盒，将masp-csmads6-noster表达盒插入到pbi121-nttpcrbkt-nttphpbhy载体的hindiii位点，得到pbi121-ntt pcrbkt-nttphpbhy-csmads6载体。

15、进一步地，所述s1中，所述s1中nttpcrbkt基因位于pbi121载体的camv 35s启动子下游和nos终止子上游之间。

16、进一步地，所述s2中，nttphpbhy基因位于psy06载体的ubi10启动子和ubi10终止子之间。

17、进一步地，所述s3中，super1300载体含有甘露糖合成酶基因启动子和nos终止子。

18、本发明还提供一种采用权利要求1所述的表达载体合成虾青素的方法，包括以下步骤：将所述的表达载体导入根癌农杆菌gv3101中，以农杆菌介导的方法进行无菌野生烟草叶片的遗传转化，从而驱动烟草叶片本身的类胡萝卜素生物合成虾青素。

19、与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：

20、(1)本发明通过将csmads6转录因子和两个调控虾青素合成的关键酶基因hpbhy和crbkt构建到pbi121载体上，从而得到pbi121-nttpcrbkt-nttphp bhy-csmads6表达载体，该表达载体能够驱动烟草叶片中生物合成虾青素，同时不会影响烟草植物的生长发育。通过类胡萝卜素靶向代谢组学和转录组学，揭示通过共表达转录因子csmads6和两个酶基因crbkt和hpbhy扩展类胡萝卜素代谢通路，从而在烟草叶片中生物合成虾青素的效应。

21、(2)本发明通过共表达一个转录因子csmads6和两个调控虾青素合成的关键酶基因hpbhy和crbkt，创制了富含虾青素的烟草新种质bbc，烟草新种质bbc叶片中富集了野生型烟草叶片不能由生物合成的虾青素、番茄红素、多种类胡萝卜素酯、角黄素和海胆酮，但不影响烟草植物的生长发育。并且通过本发明方法得到的烟草新种质叶片中类胡萝卜素酯含量是野生型烟草叶片的2.3倍，总脂含量却显著低于野生型烟草叶片中的含量。

22、(3)本发明通过共表达一个转录因子csmads6和两个调控虾青素合成的关键酶基因hpbhy和crbkt，在烟草叶片中生物合成了番茄红素；有效解决了过表达一个或多个酶基因扩展类胡萝卜素代谢通路合成虾青素时，不能生物合成番茄红素或番茄红素生物合成量低于仪器检测限的问题。

23、(4)本发明通过共表达一个转录因子csmads6和两个调控虾青素合成的关键酶基因hpbhy和crbkt，使类胡萝卜素代谢通路α-分支的终产物叶黄素的含量显著降低，而使代谢流向β-分支，生物合成虾青素。

24、(5)本发明通过虾青素对类胡萝卜素含量和组成、关键基因表达以及光合作用、脱落酸和色素相关指标的影响，为高等植物叶片通过类胡萝卜素代谢工程合成虾青素提供理论基础和技术支持。