靶向FOXM1蛋白的促聚集降解多肽、衍生物及应用

本发明涉及肝癌靶向治疗多肽领域，特别涉及靶向foxm1蛋白的促聚集降解多肽、衍生物及应用。

背景技术：

1、癌症是全世界主要的公共卫生问题，其发病率位居全球第五、癌症相关死亡率位居第三，且是近几十年死亡率增长最快的癌症类型。我国是肝癌重灾区，中国肿瘤登记年报显示，我国肝癌发病率居全部肿瘤的第5位，而死亡率却高居第2位。主要原因在于50%以上的肝癌患者为晚期，缺乏有效治疗手段。现有的肝癌靶向药物主要针对vegfr等酪氨酸激酶受体，靶点高度重合，一旦耐药，可选择的后续药物有限，寻找新的肝癌治疗靶点迫在眉睫。

2、foxm1是叉头框转录因子家族成员之一，具有调节细胞增殖、分化和器官形成的作用。目前认为，foxm1的入核转录功能在调控细胞增殖及细胞周期中发挥关键作用，进而可影响肿瘤的发生、进展及耐药。考虑到foxm1在肝癌中发挥的关键作用，人们寄希望于开发靶向foxm1的抗癌药物。然而，由于foxm1的dbd域为正电荷富集并呈凸面形状，缺乏疏水性结构和小分子结合口袋，传统小分子药物很难实现靶向效果。十余年来，尽管人们做出很多尝试，目前仍无foxm1特异性靶向药物进入临床试验。

3、“相分离”理论起源于油-水混合后的“乳化”物理现象。在细胞生物学领域，“相分离”用于解释生物大分子能从细胞液中分离出来，自发排布成无膜细胞器从而发挥功能。2021年nature rev drug discov发表综述文章，提出利用相分离开发转录因子靶向药物的设想。作为转录因子相分离研究的先驱richard young教授，于2018年成立了全球首个研究相分离调节药物的公司“dewpoint therapeutics”。该公司目前已开发出用于治疗神经退行性疾病的相分离靶向药物。在全球多个制药巨头宣布抗神经退行性疾病药物研发失败的背景下，这一成功无疑带来了新的曙光。我们筛选出一种由ncrna编码的多肽“pint”。pint多肽富含负电子和疏水键，能够竞争性结合foxm1蛋白的dna结合域，与foxm1蛋白体外共孵育后，能够显著诱导foxm1出现相分离，

4、beclin1是调控自噬前体形成的关键蛋白，用于引导蛋白底物定位于自噬体膜，协助完成自噬体膜包裹底物蛋白。2013年，nature首次报道23，将beclin1蛋白的18个氨基酸（a.a.267-284）给予hela细胞后能够显著诱导自噬体成熟，是极具潜力的多肽药物成分。受此启发，在本项目中，我们将前期发现的pint片段和beclin1的功能片段融合，设计了pint-beclin1融合多肽，以加速诱导细胞质内foxm1相分离以及自噬体包裹，实现foxm1集束化降解。本发明以foxm1相分离特征作为切入点，将其与自噬降解过程耦联，对靶向转录因子药物的开发具有开创性意义。

技术实现思路

1、为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供靶向foxm1蛋白的促聚集降解多肽、衍生物及应用。该融合多肽及其衍生物与foxm1具有特异性高亲和力，能够特异性诱导foxm1相分离并启动蛋白自噬来阻断foxm1的信号通路，该多肽及其衍生物在靶向抑制肝癌细胞增殖、促进肝癌细胞凋亡等方面起着重要的作用，其在肝癌靶向治疗方面具有巨大的应用价值。

2、发生“相分离”的关键在于分子间多价的弱相互作用。已知有两种结构的蛋白容易发生相分离：一类是具有重复结构域的蛋白；另一类是具有内部无序区的蛋白（idr）。目前已证实，转录因子绝大多数都是通过idr结构实现相分离。使用hmm算法预测发现foxm1具备相分离发生的idr结构。

3、数据库筛选出一种由ncrna编码的多肽pint。pint多肽富含负电子和疏水键，能够竞争性结合foxm1蛋白的dna结合域，体外实验结果证明pint多肽在与foxm1蛋白体外共孵育后，能够显著诱导foxm1出现相分离，经实验发现其功能片段为pint多肽的2到39位氨基酸，具体序列见seq id no:2。

4、beclin1是调控自噬前体形成的关键蛋白，用于引导蛋白底物定位于自噬体膜，协助完成自噬体膜包裹底物蛋白。2013年，nature首次报道将beclin1蛋白的267到284位功能氨基酸序列合成的多肽给予hela细胞后能够显著诱导自噬体成熟（nature,494(7436),201–206），具体序列见seq id no:3。

5、我们将前期发现的pint片段seq id no:2和beclin1的功能片段seq id no:3融合，设计了pint-beclin1融合多肽（p-b多肽），以加速诱导细胞质内foxm1相分离以及自噬体包裹，实现foxm1集束化降解。

6、为达到上述目的，本发明的技术方案为：

7、一方面，本发明提供了一种foxm1靶向降解多肽，所述多肽是基于相分离原理的foxm1靶向集束化降解的pint-beclin1融合多肽，其氨基酸序列如seq id no:1所示，核心活性成分为seq id no：2所示相分离诱导序列和seq id no：3所示自噬诱导序列。

8、另一方面，本发明提供了一种foxm1靶向降解多肽的衍生物，所述foxm1靶向降解多肽的衍生物为保留权所述的核心活性成分seq id no：2和seq id no：3的基础上对seqid no:1氨基酸序列替换、缺失、插入和/或添加一个、两个或数个氨基酸得到的产物；

9、上述所述化学修饰包括氨基化、酰胺化、羟基化、羧基化、羰基化、烷基化、乙酰化、磷酸化、酯化、糖基化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇peg修饰或固定化修饰；

10、进一步地，所述foxm1靶向降解多肽的衍生物为上述所述的seq id no:1氨基酸序列替换得到的产物。

11、进一步地，所述foxm1靶向降解多肽及其衍生物的获得，既可以采用多肽自动合成仪进行化学合成；也可以通过将多肽序列推导出核苷酸序列，然后插入表达载体中进行生物合成。

12、合成所述多肽的方法，是将含所述多肽序列与穿膜肽序列融合，利用多肽自动合成仪或生物合成系统制备得到具有穿膜能力的多肽。

13、进一步地，本发明提供了一种dna编码序列，其编码上述所述的foxm1靶向降解多肽或其衍生物。

14、进一步地，本发明提供了一种包含上述所述的dna编码序列的表达载体。

15、进一步地，本发明提供了一种转染了上述所述表达载体的宿主细胞。

16、进一步地，本发明提供了一种上述所述的foxm1靶向降解多肽或其衍生物在制备治疗高表达foxm1的肿瘤的药物中的应用。

17、进一步地，本发明提供了一种上述所述的foxm1靶向降解多肽或其衍生物在制备抑制高表达foxm1的肿瘤细胞增殖和/或促进高表达foxm1的肿瘤细胞凋亡的药物中的应用。

18、进一步地，所述高表达foxm1的肿瘤包括肝癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌，优选为肝癌。

19、相对于现有技术，本发明的有益效果为：

20、(1)本发明提供了靶向foxm1蛋白的促聚集降解多肽、衍生物及应用，所述的靶向降解多肽及其衍生物能够特异性与foxm1结合，诱导foxm1发生相分离，并诱导foxm1发生蛋白自噬降解，特异性抑制foxm1信号通路。

21、(2)本发明提供的foxm1拮抗多肽及其衍生物可以通过阻断foxm1的信号通路抑制癌细胞增殖，促进癌细胞发生凋亡，可以作为foxm1结合位点的生物类多肽药物，可用于治疗肿瘤。能够在医学与生物学领域得到广泛的应用，并产生巨大的社会与经济效益。