基于Kil蛋白构建释放抗肿瘤效应蛋白的系统及方法

本发明属于生物，具体涉及一种基于kil蛋白构建释放抗肿瘤效应蛋白的系统及方法。

背景技术：

1、使用活细菌治疗肿瘤的方法于19世纪末就已进行临床实践，这被认为是最原始形式的免疫治疗。现代动物实验研究显示，细菌在特定剂量内展现出良好的安全性及肿瘤治疗效果。部分细菌有向肿瘤内部厌氧环境生长定植的趋势，因此具有肿瘤靶向性；细菌作为完整原核生物，有合成复杂生物大分子增强肿瘤治疗效果的能力；细菌主要通过自身细胞毒作用及感染宿主后激活免疫系统发挥抗肿瘤功能，这使得细菌治疗具有突破免疫豁免微环境，克服因遗传学所致肿瘤的不良预后而成为通用型治疗手段的潜力。2002年，journalof clinical oncology杂志发表的人体临床试验结果表明，被认为具有肿瘤靶向性质的减毒鼠沙门氏菌（attenuated salmonella typhimurium）通过静脉注射，能在安全剂量范围内成功定植于部分患者的转移性黑色素瘤中，但未能表现出抗肿瘤效应。该临床试验结论认为，无法在安全范围内继续增加细菌剂量增强肿瘤内细菌定植是未像在动物实验中表现出细菌抗肿瘤效应的主要原因。因此，目前主流观点认为，成功的细菌肿瘤治疗需要在兼顾安全性的同时提高细菌的靶向性及抗肿瘤能力。

2、合成生物学是一门结合了基因工程、系统生物学、控制学等学科的交叉学科，其强调模块化构建基因元件、装置和系统，在目标生物体中达到目标功能。通过基因工程或合成生物学手段被改造后的细菌即为工程化细菌。2016年，nature杂志首次报道了应用合成生物学技术改造细菌治疗合并肝转移的结肠癌小鼠的研究，极大地推动了细菌治疗肿瘤领域的进步。2018年以来，数篇基于合成生物学手段提升细菌肿瘤治疗效果的文章被报道，为该领域带来了更多的可能性。上述研究中部分使用了一种基于菌群感应的周期性细菌裂解系统释放具有治疗功能的蛋白，在肝转移结肠癌及淋巴瘤小鼠模型中取得了良好的治疗效果。周期性的细菌裂解系统保证了细菌合成产物的持续释放，使得细菌可以通过直接细胞穿孔作用或增强吞噬细胞及细胞毒性t细胞（cytotoxic tlymphocyte）的杀伤能力增强抗肿瘤效应，并将细菌维持在较低的数量上，显著提高了治疗的安全性。使用毒性较低、易于基因操作的细菌作为载体，利用其复杂的生物合成系统作为“细胞工厂”参与肿瘤治疗，加强细菌肿瘤靶向性及杀伤能力或增强宿主免疫反应以治疗肿瘤已成为细菌治疗肿瘤的新发展方向。

3、然而，当前肿瘤的细菌治疗中仍然存在着一些问题：1）细菌自身分泌系统不发达，其产生的蛋白类活性产物难以分泌至胞外，限制了细菌的杀伤作用。2）需要限制细菌的毒性，以确保治疗安全性。因此，在改造细菌治疗肿瘤的相关研究中，由于细菌分泌系统不发达，往往需要通过裂解细菌的方法释放细菌中合成的治疗物质。同时，裂解细菌也可以降低细菌数量，从而提高细菌治疗的安全性。这也是前文所述研究使用基于菌群感应的周期性裂解系统释放蛋白的原因。该系统优势在于可以稳定释放蛋白，并降低一段时间内的总体细菌数量负荷以提高安全性。但对于使用蛋白作为治疗物质的工程菌而言，基于菌群感应的周期性裂解系统治疗性蛋白实际释放量低下；且在周期震荡低点时细菌容易被免疫系统清除，这显著影响了其长效定植能力。需要更优化的手段来解决该问题。

4、随着抗体工程的进步，人们已经可以在细菌中表达有生物活性的抗体成分，包括传统抗体的单链可变区（single-chain variable fragment，scfv）及来自于重链抗体的纳米抗体（nanobody）。这为细菌治疗和免疫治疗的联合使用奠定了技术基础。纳米抗体是羊驼仅重链抗体（camelid heavy-chain only antibodies，camelid hcabs）的可变区片段，即单可变域（variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody，vhh）。是目前发现的分子量最小（~15kda）的天然抗原结合片段。由于分子量小，纳米抗体具有良好的组织渗透性。且在37℃的环境中能够保持数周生物活性，具有良好的化学稳定性。虽然针对成年获得性血栓性血小板减少性症的纳米抗体药物已于2019年上市，但对于肿瘤性疾病而言，由于缺乏fc段，纳米抗体往往需要和其他单克隆抗体联用或作为car-t或含fc段抗体的一部分才能发挥抗肿瘤效应。如一篇使用抗鼠cd47纳米抗体的文献表明，在小鼠中单独使用抗鼠cd47纳米抗体作为治疗物质并不能延长小鼠在改造细菌进行治疗肿瘤的过程中，需要细菌内部表达治疗类蛋白并将其成功分泌、降低细菌毒性以增加治疗安全性。

5、细菌表达的纳米抗体需要释放至细菌胞外才能发挥作用。然而，细菌表面转运系统本身难以将外源基因表达的重组蛋白分泌至胞外。通过毒性蛋白直接裂解细菌释放蛋白是一种解决该问题的有效方法。

6、目前使用合成生物学思路改造细菌治疗肿瘤的研究中，最经典的裂解方法为2016年nature杂志发表的，基于ahl菌群感应系统的同步裂解释放系统 (doi: 10.1038/nature18930)。其原理为：n-酰基-高丝氨酸内酯（n-acyl-homoserine lactones，ahl）是一种由luxi蛋白合成，在细菌间自由扩散的小分子，其和细菌中组成型表达的luxr蛋白结合后形成的ahl-luxr复合物可诱导型启动luxi启动子，从而启动luxi、φx174e短肽及目的蛋白的表达。来源于噬菌体φx174（phix174）的φx174e基因，其可以编码一段含有91个氨基酸的短肽，该短肽可通过抑制大肠杆菌转位酶mray活性直接抑制脂质i（lipid i）的形成，从而抑制大肠杆菌细胞壁的形成造成细菌死亡裂解。luxi的表达量增加，ahl产生增多，会正反馈继续激活φx174e短肽及目的蛋白的表达，且由于ahl的自由扩散，细菌菌群间几乎保持着同步状态。最终，在φx174e短肽的作用下，绝大数细菌同步死亡，目的蛋白被成功释放。然而，由于局部浓度差异，总存在未死亡的细菌。在ahl平均浓度随液体交换等原因导致浓度下降时，未死亡的细菌即重新开始上述过程。该过程已被证明在动物体内仍能有效工作。

7、虽然上述的同步裂解系统达到了减低细菌毒性和成功释放产物的目的，但其也存在一定的缺陷：（1）同步裂解系统会导致在震荡低点时，细菌容易被免疫系统清除，降低定植效率。（2）反复将细菌裂解至低种群量，会造成细菌蛋白总产量因反复的菌群数量下降而大量减少。

8、在原文献中使用了小动物活体成像系统（in vivo imaging system，ivis）检测了自带生物荧光细菌在小鼠体内情况。其结论显示，不含同步裂解系统的对照组细菌生长至平台期后保持了较高的生物荧光信号，而含有同步裂解系统的实验组细菌出现了如上述描述式的周期性荧光信号变化。通过提取了原始研究动物实验中的图像数据结果，使用matlab绘制了其体内生物荧光信号的变化情况。由于原文献已记载：目的蛋白表达情况与细菌生长状态同步，几乎一致。因此，可以使用描述菌群数量的logistic曲线模拟不含该裂解系统时，细菌荧光量的变化。结果如图1所示，图1中横坐标为时间（小时），纵坐标为生物荧光信号强度。图下方线为提取自jeff hasty等于nature报道的，使用ivis检测自带生物荧光及菌群感应释放系统细菌在小鼠体内的生物荧光信号（已标注）。上方线为使用logistic方程，在设定实验组最大环境容纳量定为k的情况下，按照原始文章中ivis信号拟合的，不含裂解系统的细菌生长曲线（已标注）。阴影部分分别为：（上）对照组若由k下降至1/2 k时荧光信号减少量、（下）实验组实际荧光信号减少量。从图1中可以看出，在对数期末尾使用外界因素使对照组细菌数量达到1/2 k时，细菌的荧光信号降低量，即所释放的蛋白产物数量将远高于同步裂解释放系统。模拟结果显示，通过非同步裂解手段，在靠近平台期裂解细菌，可明显增加目的产物的释放量。综上，急需设计全新的裂解系统以改善细菌目的产物的释放，并同时降低工程菌毒性。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供基于kil蛋白构建释放抗肿瘤效应蛋白的系统及方法。本发明基于kil蛋白，建立了一种细菌持续释放蛋白类物质的系统，该系统可以使细菌在种群数量较高时稳定释放细菌中同时表达的蛋白类治疗物质。kil蛋白是一种源于大肠杆菌的细菌素释放蛋白（bacteriocin release protein，brp）。在自然低表达量下，能破坏细菌外膜，释放周质空间内的物质。通过在工程菌中表达kil蛋白，同时在细菌中表达治疗效应蛋白（例如cd47纳米抗体和pd-l1纳米抗体），来激活免疫系统达到杀伤肿瘤的目的。kil蛋白在表达后可介导细菌死亡，以避免细菌继续大量扩增，增加了安全性。在动物实验中，上述系统表现出对肿瘤的显著治疗效果，并显著增加了治疗安全性。

2、本发明的技术方案为：

3、一种基于kil蛋白构建的释放抗肿瘤效应蛋白的系统，包括kil蛋白表达模块和治疗效应蛋白模块，所述kil蛋白表达模块包括用于表达kil蛋白的启动子、rbs、kil蛋白序列和终止子，所述治疗效应蛋白模块包括表达治疗效应蛋白的启动子、rbs、治疗效应蛋白序列和终止子。

4、所述kil蛋白序列的核苷酸序列如seq id no.1所示。

5、所述治疗效应蛋白序列为cd47纳米抗体序列和/或pd-l1纳米抗体序列。

6、所述用于表达kil蛋白的启动子为j23109、j23114、j23115中的任一种或几种的组合。

7、所述用于表达kil蛋白的启动子j23109的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述用于表达kil蛋白的启动子j23114的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述用于表达kil蛋白的启动子j23115的核苷酸序列如seq id no.4所示。

8、所述kil蛋白表达模块的rbs的核苷酸序列为aagaaggaa。

9、所述kil蛋白表达模块的终止子的核苷酸序列如seq id no.5所示。

10、所述系统的核苷酸序列分别如seq id no.9、seq id no.10、seq id no.11、seqid no.12、seq id no.13、seq id no.14、seq id no.15、seq id no.16所示。

11、所述系统在制备抗肿瘤产品中的应用。

12、所述基于kil蛋白构建的释放抗肿瘤效应蛋白的系统，其构建方法为：基于分子生物学方法将kil蛋白在细菌中通过质粒载体和/或插入基因组表达，并同时在细菌中通过质粒载体和/或插入基因组表达治疗效应蛋白。

13、需要说明的是，本发明所述系统中的kil蛋白表达模块，还包括基于突变kil蛋白序列形成的kil蛋白表达模块。

14、本发明的有益效果为：

15、本发明所述的基于kil蛋白构建的释放抗肿瘤效应蛋白的系统，包括kil蛋白表达模块和治疗效应蛋白模块，所述kil蛋白表达模块包括用于表达kil蛋白的启动子、rbs、kil蛋白序列和终止子，所述治疗效应蛋白模块包括表达治疗效应蛋白的启动子、rbs、治疗效应蛋白序列和终止子。本发明通过基于kil蛋白建立了一种细菌持续释放蛋白类物质的系统，所述系统能够使细菌在种群数量较高时稳定释放细菌中同时表达的蛋白类治疗物质。本发明通过在工程菌中表达kil蛋白，同时在细菌中表达纳米抗体治疗性蛋白物质，来激活免疫系统达到杀伤肿瘤的目的。数据显示，本发明所述组成型表达kil蛋白的工程菌会降低细菌的活力，以提高细菌治疗的安全性，但同时可以保证细菌数量在一定水平以达到充分释放治疗物质的目的。