一种SIDT1单克隆抗体及其制备方法与流程

本发明涉及抗体制备，尤其涉及一种sidt1单克隆抗体及其制备方法。

背景技术：

1、rna一直以来被认为是基因和蛋白之间信息的传递者，其中非编码rna(non-coding rna)是指不编码蛋白质的rna，因为其不能传递信息而一度被认为是“垃圾rna”。非编码rna包括rrna，trna，snrna，snorna和microrna等多种已知功能的rna，还包括许多未知功能的rna。这些rna的共同特点是来自于基因组的转录，但是不翻译成蛋白，在rna水平上就能行使各自的生物学功能。随着非编码rna研究的深入，人类对rna的认知一次又一次被刷新，非编码rna很有可能就是解开生命奥秘的重要环节，在生物体发育，疾病，肿瘤等过程非编码rna都起着重要作用。

2、rna干扰(rnai)是生物体内源基因发生转录后特异性降解的一种生理现象，作为抵抗一种病毒的免疫机制广泛存在于生物体内。rnai是一种转录后的基因沉默机制，是指内源性或外源性双链rna(doμble strand rna,dsrna)介导的细胞内mrna发生特异性降解，沉默靶基因的表达并产生相应的功能表型缺失的技术。

3、rna干扰由双链rna(doμble-stranded rna，dsrna)诱发，通过高效特异性降解同源mrna从而抑制基因的表达。以rna为基础的药物和疫苗研发一直在进行，尤其是利用rnai特异性的沉默某些致病基因的表达更是研究的热点。rnai可以在转录后水平特异性的沉默某些基因，而且这种调控又是一种可逆的反应，使其成为一种极具吸引力的药物研发工具。

4、micrornas(mirna)作为一种小的非编码rna广泛存在于动植物以及病毒中，其可能作为重要的信息传递载体调控基因的表达，调控细胞的代谢，甚至在肿瘤的产生，发展和抗药性的产生中，microrna也起到重要的作用，因而受到越来越多的重视。虽然还不清楚人类的micrornas是否像线虫或者植物中干扰rna那样沉默基因的表达，调控代谢，或是抵御病毒，但是实验证据表明mirna表达谱在一些肿瘤中确实发生了改变，这暗示mirna可能参与了癌症和其他疾病的发展。

5、除此之外，外源mirna也可以进入人体进行基因水平的调控。在植物中，一种叫做mir168a的mirna在大米中大量存在，并且由于食物的摄入，在中国人的血清中浓度很高，是人体中高度富集的外源植物mirna之一。体内体外实验均可证明mir168a可以结合人/鼠的低密度脂蛋白受体调节蛋白1(low-density lipoprotein receptor adapter protein 1)的mrna，抑制其在肝脏中的表达，进而影响低密度脂蛋白的浓度。这是典型的植物mirna通过食物进入哺乳动物调节哺乳动物基因表达的例子。在这个研究中mir168a是单链形式，被包装成细胞微泡(microvesicles)通过胃肠道进入循环系统。

6、通过以上的研究可以看出，非编码rna携带的遗传信息可以精准的在基因水平上调节细胞的生理活动，而rna传递的通道更是信息传递的关键，所以了解通道蛋白对rna的识别和运输机制是十分必要的。

7、干扰rna系统在线虫中起到重要的调节作用，而sid-1蛋白作为dsrna的通道又是信息传递的关键。sid-1同源蛋白同时也存在于无脊椎动物，在脊椎动物中更有广泛分布，证明这个蛋白家族可能是有古老的起源并且一直保持着相对保守的功能。越来越多的证据表明，rna不再仅仅是dna和蛋白质之间信息的传递者，其本身就具有重要的生理功能，它们来自于基因组转录但却不编码蛋白，在rna水平上行使特定的功能。sid-1及其同源蛋白sidt1/sidt2等，特异性识别dsrna，并作为其特异性的重要通道使其进入细胞或者让信息在细胞间传递，可能是解析非编码rna调控功能重要的环节。但是迄今为止关于这个蛋白的功能及机制的研究才刚刚开始，我们希望通过这个项目的研究，从结构上解析这个复杂跨膜糖蛋白的结构特征，研究dsrna通过进入细胞的分子机制。以结构为基础，更加深刻的理解dsrna对细胞的调控，进而深入的研究这个蛋白的功能和复杂的rna调控网络。

技术实现思路

1、本发明第一个方面提供了一种sidt1单克隆抗体的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

2、s1.制备sidt1 ecd蛋白抗原；

3、s2.利用昆虫细胞表达sidt1 ecd，并进行小鼠单克隆抗体的制备；

4、s3.sidt1全长蛋白制备；

5、s4.鼠单克隆抗体制备。

6、在一些实施方式中，所述制备sidt1 ecd蛋白抗原的方法包括：

7、(1)合成sidt1胞外段基因克隆进入昆虫表达载体pmt/bip/v5-his a中；

8、(2)提取构建好的质粒并利用试剂盒进行内毒素去除；

9、(3)六孔板内按19:1比例转染含目的基因质粒和pcohygro(pmt/v5)进入果蝇s2细胞，并用潮霉素b进行筛选杀死未转染的细胞；

10、(4)利用含潮霉素b的培养基进行细胞扩增；

11、(5)把全部细胞放入培养瓶中悬浮搅拌，铜离子诱导蛋白表达；

12、(6)72h后收集培养基上清，利用密理博超滤系统进行换液除去培养基；

13、(7)利用镍填料、sμperdex 200在cytiva aktapμre系统进行蛋白精细纯化；

14、(8)提纯的蛋白稀释到1mg/ml并且利用0.22μm过滤膜进行除菌并冻存于超低温冰箱。

15、在一些实施方式中，所述鼠单克隆抗体制备的方法包括：注射0.5ml液体石蜡至8周龄balb/c小鼠腹腔，将杂交瘤细胞以1×105个/ml的浓度接种于25cm2培养瓶内，培养至细胞活性状态最佳，将细胞数量调至约1×106接种到已注射液体石蜡的小鼠腹腔，7-10天后收集腹水。

16、本发明第二个方面提供了一种sidt1单克隆抗体，由所述的制备方法制备得到。

17、在一些实施方式中，所述抗体分为2b11、6h10、5g9、5h9、3b12五种亚型。

18、在一些实施方式中，所述抗体特异性由强至弱的程度依次为：5h9、2b11、6h10、5g9、3b12。

19、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

20、1、本发明首次制备出了针对sidt1-ecd的单克隆抗体，而现有单抗几乎都是以多肽为抗原。

21、2、本发明制备的单克隆抗体对sidt1全长蛋白和胞外区均有特异性反应。

技术特征：

1.一种sidt1单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的sidt1单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述制备sidt1ecd蛋白抗原的方法包括：

3.根据权利要求1所述的sidt1单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述鼠单克隆抗体制备的方法包括：注射0.5ml液体石蜡至8周龄balb/c小鼠腹腔，将杂交瘤细胞以1×105个/ml的浓度接种于25cm2培养瓶内，培养至细胞活性状态最佳，将细胞数量调至约1×106接种到已注射液体石蜡的小鼠腹腔，7-10天后收集腹水。

4.一种sidt1单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1-3任一项所述的制备方法制备得到。

5.根据权利要求4所述的sidt1单克隆抗体，其特征在于，所述抗体分为2b11、6h10、5g9、5h9、3b12五种亚型。

6.根据权利要求5所述的sidt1单克隆抗体，其特征在于，所述抗体特异性由强至弱的程度依次为：5h9、2b11、6h10、5g9、3b12。

技术总结
本发明涉及抗体制备技术领域，尤其涉及一种SIDT1单克隆抗体的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：S1.制备SIDT1ECD蛋白抗原；S2.利用昆虫细胞表达SIDT1ECD，并进行小鼠单克隆抗体的制备；S3.SIDT1全长蛋白制备；S4.鼠单克隆抗体制备。本发明首次制备出了针对SIDT1‑ECD的单克隆抗体，而现有单抗几乎都是以多肽为抗原，制备的单克隆抗体对SIDT1全长蛋白和胞外区均有特异性反应。

技术研发人员：汪涛,邬玉兰,刘丽
受保护的技术使用者：深圳湾实验室
技术研发日：
技术公布日：2024/4/24