一种抗哇巴因的纳米抗体及其应用

本发明属于纳米抗体，具体涉及一种抗哇巴因的纳米抗体及应用。

背景技术：

1、哇巴因(ouabain)是强心甾类化合物的一种，广泛的存在于洋地黄类植物中，具有很高的药用价值。1785年英国民间医生wellington用甾体类植物药洋地黄水煎液治疗水肿效果显著，引起医学界广泛关注。上个世纪中叶，欧美制药企业竞相开发强心甾类药物，最著名的是地高辛制剂，对多种心血管疾病有独特疗效，历经数十年仍为临床充血性心力衰竭等心脏疾病治疗的重要药物。作为强心甾化合物，哇巴因也能够用于心脏衰竭、心律不齐的治疗。在生物学机制上，哇巴因主要通过抑制细胞膜上na+/k+-atpase发挥作用。哇巴因抑制na+/k+-atpase使得细胞内的na+水平上升，na+水平上升抑制纳钙交换体的活性，使得细胞内的ca2+浓度上升，激活ca2+相关的信号通路，发挥增强心肌收缩能力和治疗心脏衰竭的作用。目前很多国家包括美、法、德等停止哇巴因的临床使用，主要原因在于哇巴因治疗窗口窄，治疗剂量与中毒剂量接近，一旦超剂量使用极其容易中毒。但也有科学家认为哇巴因可以通过口服等方式，降低毒性，用于治疗心绞痛和心肌梗死。20世纪末，美国hamlyn jm教授在nature杂志发表研究论文，证明人体存在内源性哇巴因，研究人员在300l的人体混合血浆中，通过质谱检测并纯化出这种特殊的物质。hamlyn jm教授还发现内源性哇巴因化学结构与植物或者蟾蜍来源的哇巴因结构相似，以及它们是通过肾上腺分泌进入代谢循环，在调节动脉压、心脏以及肾脏功能中发挥重要作用。进一步研究发现，哇巴因与免疫、肿瘤、病毒感染等疾病发生和进展关系密切，提示其可能存在心血管系统之外的新生物学功能。要证实这一猜想，需要对哇巴因在体内过程有着更清晰的认识，对哇巴因进行准确的定量，并研发能够封闭哇巴因的新型抗体。

2、自1975年杂交瘤技术诞生以来，单克隆抗体药物被广泛地应用于多种疾病的诊断与治疗，成为当今研究热潮之一。该技术在肿瘤治疗诊断、分子检测等领域取得重要进展。在肿瘤治疗方面，传统单抗能靶向肿瘤细胞对其产生杀伤作用，甚至能够导致肿瘤细胞发生程序性坏死。在诊断方面，抗体标记放射性同位素或荧光素在pet检测和疾病影像学中发挥重要作用。单克隆抗体具有靶向特异性，制备工艺成熟，易于标记等优势。但随着应用领域的扩展，单克隆抗体的缺点也愈发明显。首先，单克隆抗体的分子量较大，导致其在体内外不稳定；其次单克隆抗体免疫原性强，可能给机体带来较为严重的排斥反应。此外，单克隆抗体在分子成像应用时信号背景过高，在疾病临床中应用具有一定的局限性。因此，目前掀起了开发新型抗体的浪潮，最具代表性的就是小分子抗体主要包括fab片段、单链抗体、纳米抗体等。

3、纳米抗体(nanobody，nb)是新型小分子抗体一种，起初是1993年hamerscasterman等人在骆驼体内发现的重链抗体可变区序列。进一步研究发现，在骆驼血清中天然存在两种结构的抗体。一种抗体为具有两条重链和两条轻链的常规四聚体抗体，另一种是缺失两条轻链仅有重链的重链抗体。重链抗体的可变区构成单链抗体，其缺乏轻链也没有典型的恒定重链ch1结构域，相对分子质量为15kda左右，为常规抗体的1/10，分子体积约为4.8nm*2.2nm。这是一种特殊并天然存在的小分子抗体，是迄今为止发现最小的具有生物活性的功能性片段。在骆驼或鲨鱼中，这些重链抗体仅通过单个可变区可识别抗原从而拥有生物活性。因此，nb是最小的完整性抗原结合域。这种新型抗体存在于骆驼、软骨鱼等动物的体内，其结构与生理功能与单克隆抗体相似，具有极大的应用前景。nb比起单克隆抗体乃至其它抗体具有独特优势，其亲和力高、稳定性好、更容易实现在微生物体内的可溶性表达，极大地降低了生产周期与生产成本，在多种疾病的精准诊断、靶向治疗、食品安全监测等领域具有广阔的应用空间。

4、本发明旨在为构建轻量化、高亲和力哇巴因nb，为建立热稳定且高灵敏性哇巴因检测方法提供了材料；为深入挖掘内源性哇巴因的新生物学功能提供研究工具。

技术实现思路

1、本发明的目的是利用基因工程的方法研制分子量小、结合能力强与性质稳定的新型哇巴因nb，基于哇巴因nb建立elisa免疫检测法检测哇巴因含量，为相关研究提供工具。

2、为了实现以上目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

3、本发明提供一种抗哇巴因的纳米抗体，所述纳米抗体的氨基酸序列如seq idno.1所示：evqllqsgglaqpggslrltctasigavyvmgwyrqppgkqrelvasitsagitnytds vksrfiisrdntkntvylqmnslkpedtavyycnaplrgrddyggfdwgqgtqvtvss。

4、seq id no.1中，1-23是所述纳米抗体的框架区fr1的氨基酸为：evqllqsgglaqpggslrltcta(seq id no.3)；24－40是所述纳米抗体的框架区fr2的氨基酸为：mgwyrqppgkqrelvas(seq id no.4)；41－78是所述纳米抗体的框架区fr3的氨基酸为：nytdsvksrfiisrdntkntvylqmnslkpedtavyyc(seq id no.5)；79－89是所述纳米抗体的框架区fr4的氨基酸为：wgqgtqvtvss(seq id no.6)；90－96是所述纳米抗体的互补决定区cdr1的氨基酸为：sigavyv(seq id no.7)；97－103是所述纳米抗体的互补决定区cdr2的氨基酸为itsagit(seq id no.8)；104－117是所述纳米抗体的互补决定区cdr3的氨基酸为naplrgrddyggfd(seq id no.9)。

5、本发明还提供所述的纳米抗体的编码基因，所述基因的核苷酸序列如seq idno.2所示：gaagttcagctgctgcaatccggtggtctggcacaaccgggtggttccctgcgcctgacctgtacggcttctattggtgcggtttacgttatgggttggtatcgccaaccacctggcaaacagcgtgaactggttgcatccatcaccagcgcgggtattactaattataccgacagcgtgaagtctcgtttcatcatcagccgcgataatactaaaaacaccgtttacctgcagatgaacagcctgaaacctgaagatacggcggtttattattgtaacgctccgctgcgtggtcgtgacgattatggtggtttcgattggggtcaaggtactcaagttactgtaagcagc。

6、本发明提供一种包含所述抗哇哇巴因的纳米抗体的基因的重组质粒。

7、本发明提供一种包含所述重组质粒的表达宿主细胞。

8、本发明还提供了所述抗哇巴因的纳米抗体的制备方法，其特征在于，将重组质粒转化至bl-21基因工程菌,诱导后通过his-tag purification resin进行初步纯化，然后通过akta离子交换进行进一步精纯而制得。

9、本发明提供了所述抗哇巴因的纳米抗体在制备elisa方法检测哇巴因的制剂中的应用。本发明提供一种检测所述的哇巴因的试剂盒，所述试剂盒基于竞争elisa法检测哇巴因，所述试剂盒以seq id no.1所示的纳米抗体为检测抗体。

10、本发明提供一种检测哇巴因的方法，包括以下步骤：

11、(1)抗体浓度的优化：加入浓度为20ng/ml的哇巴因-ova 100μl至吸附96孔elisa板，过夜包被；弃掉孔内液体，用pbst洗涤5遍，加入100μl的ova室温封闭1h；弃掉孔内液体，用pbst洗涤5遍，加入一系列浓度的生物素化的哇巴因纳米抗体室温孵育2h；弃掉孔内液体，用pbst洗涤5遍，加入100μl链霉素-hrp，室温孵育1h；弃掉孔内液体，用pbst洗涤5遍，加入100μltmb显色液体，37℃孵育10min后，加入50μl显色终止液。酶标仪于450nm处检测吸光度；选取最佳的抗体浓度用于后续的检测实验。

12、(2)竞争elisa检测方法：加入浓度为20ng/ml的哇巴因-ova 100μl至高吸附96孔elisa板，过夜包被；弃掉孔内液体，用pbst洗涤5遍，加入100μl的ova室温封闭1h；弃掉孔内液体，用pbst洗涤5遍，对于标准品组，加入浓度为20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.6ng/ml的哇巴因各100μl。对于空白对照组(b0)加入100μl的pbs。对于检测组加入100μl的待测血清样本。在每个样品孔中加入fitc标记的哇巴因纳米抗体，室温孵育2h；弃掉孔内液体，用pbst洗涤5遍，加入100μl链霉素-hrp，室温孵育1h；弃掉孔内液体，用pbst洗涤5遍，加入100μl tmb显色液体，37℃孵育10min后，加入50μl显色终止液。酶标仪于450nm处检测吸光度；所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值(b)除以第一个空白(0标准)的吸光度值(b0)再乘以100％，即百分吸光度值；以哇巴因浓度的对数值为x轴，百分吸光度值为y轴，绘制标准曲线图。根据样品百分吸光度值，可从曲线上得到对应点的横坐标，即为哇巴因浓度的对数值，求得反对数值即为测定样本中哇巴因浓度c。

13、本发明提供一种能够用哇巴因纳米抗体在体外显著发挥中和与拮抗哇巴因药理活性功能的应用。

14、本发明公开以下技术效果:

15、本发明制备抗原免疫羊驼并监测免疫反应，分离纯化免疫羊驼淋巴细胞提取其总rna。基于噬菌体展示技术构建出库容量较大的噬菌体文库，文库经过dna测序以及数据库分析，具备良好的多样性与插入率，符合筛选纳米抗体的要求。通过抗原哇巴因-ova富集文库，经过三轮固相生物淘选后，有效富集文库中阳性克隆。采用间接elisa方法多轮筛选获得多条克隆序列与哇巴因抗原存在较强的信号反应。将筛选出的克隆序列原核表达并纯化，获得较高纯度抗体蛋白，通过mst测定抗体蛋白与哇巴因的结合能力。筛选获得高亲和力的哇巴因纳米抗体，并验证其在体外的生物活性，结果表明本发明所述哇巴因纳米抗体能够发挥中和与拮抗哇巴因药理活性作用。

16、本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：

17、本发明获得的纳米抗体具有相对分子质量小、亲和力较高、生产成本较低可实现大量表达等优势。可被应用于生物样品哇巴因含量的检测，以及作为中和抗体拮抗哇巴因药理活性功能。并且本发明制备小分子纳米抗体的方法具有普适性，可用于靶向其他小分子物质纳米抗体的筛选与制备，具有较高的应用价值。