本发明属于微生物领域，具体涉及一种促进α-乳白蛋白表达的信号肽及重组菌株和应用。
背景技术：
1、α-乳白蛋白（α-lactalbumin，α-la）是哺乳动物乳汁中一种重要的乳清蛋白，广泛存在于人、牛、羊、骆驼、马、荷兰猪、兔、鼠等乳汁中，是由哺乳动物乳腺腺泡上皮细胞合成的特殊蛋白质。大部分哺乳动物的α-乳白蛋白有143个氨基酸组成，分子量为14.174 kda。由于二硫键的存在，它具有很强的热稳定性，在70℃时只有6%的部分会出现变性的情况，是乳清蛋白中热稳定性最强的一类蛋白。α-乳白蛋白还含有微量糖基成分，有n-乙酞氨基葡萄糖、唾液酸、半乳糖、n-乙酞氨基半乳糖、甘露糖、岩藻糖等。α-乳白蛋白在婴儿的生长发育中起着至关重要的作用，是婴儿必需氨基酸和支链氨基酸的极好来源，也是调节睡眠、食欲情绪的重要因子，有较高的营养价值。α-乳白蛋白能够提高紧张状态下的认知能力，夜间摄入α-乳白蛋白会提高清晨大脑的注意力和反应能力，还能够提高女性或者抑郁症病人的记忆力。另外，α-乳白蛋白具有抗膀胱癌、杀死肿瘤细胞的作用，还能增加脑内血清生成、改善情绪以及降低皮脂浓度，具有细胞溶解活性等多种功能。
2、近年来随着合成生物学的快速发展，许多重要的食品成分和功能性食品添加剂都可以利用细胞工厂来进行高效安全地合成，包括乳铁蛋白、人乳低聚糖等。近年来对于α-乳白蛋白的异源表达主要集中在转基因动物乳腺生物反应器中，而对于其在微生物体系中表达的研究较少。
3、枯草芽孢杆菌具有明确的遗传背景和一系列基因组工程工具，这使得枯草芽孢杆菌成为生物生产的重要宿主。与真核表达系统相比，枯草芽孢杆菌具有培养简单、生长速度快等优点。与目前研究充分的大肠杆菌之类的革兰氏阴性菌表达系统比较来说，枯草芽孢杆菌表达系统可以一定程度上避免蛋白质在细胞内积累以及形成不溶性的包涵体而出现毒性，因此，其迅速成为代谢工程和合成生物学研究有竞争力的主体。
4、本发明成功克隆人α-乳白蛋白基因并在枯草芽孢杆菌中高效表达，并对其做了安全性评价，为婴幼儿配方奶粉深度模拟人乳，进一步开发生物工程乳奠定了基础。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种促进α-乳白蛋白表达的信号肽及重组菌株和应用。所述信号肽能够提升α-乳白蛋白的产量，且制备得到了由最佳信号肽yjcn和启动子构建的重组菌株rik1285-pbe-pglv-yjcn- lalba，具有大规模生产α-乳白蛋白的潜力。
2、为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
3、本发明提供了一种促进α-乳白蛋白表达的信号肽，其氨基酸序列如seq id no.12所示、或者如seq id no.13所示、或者如seq id no.14所示、或者如seq id no.15所示、或者如seq id no.16所示。
4、本发明还提供了一种促进α-乳白蛋白表达的重组菌株，其中含有所述的信号肽的编码基因以及启动子。
5、进一步的，所述启动子的核苷酸序列如seq id no.17所示、或者如seq id no.18所示。
6、进一步的，所述重组菌株选自枯草芽孢杆菌。
7、进一步的，所述重组菌株的构建方法包括以下步骤：
8、（1）将α-乳白蛋白的基因序列优化后，构建于质粒上，以得到的重组质粒质粒为模版进行扩增，得到α-乳白蛋白的基因片段 lalba；
9、（2）对穿梭质粒pbe-s进行酶切后，将其与所述步骤（1）的 lalba基因片段进行连接，得到重组质粒pbe- lalba；
10、（3）对所述步骤（2）的重组质粒pbe- lalba进行酶切后，将其与所述信号肽的编码基因进行连接，得到含有信号肽的重组质粒pbe-信号肽- lalba；
11、（4）对所述步骤（3）的重组质粒pbe-信号肽- lalba进行酶切，同时合成所述启动子并扩增，将得到的扩增产物与酶切产物进行连接，连接产物转入枯草芽孢杆菌感受态细胞中，得到含有信号肽和启动子的重组菌株rik-pbe-启动子-信号肽- lalba。
12、进一步的，所述步骤（1）中扩增的引物序列如seq id no.1和seq id no.2所示。
13、进一步的，所述酶切产物与基因片段或扩增产物的质量比为200:2-3。
14、本发明还提供了所述的信号肽或者所述的重组菌株在生产α-乳白蛋白中的应用。
15、进一步的，所述重组菌株生产α-乳白蛋白的培养条件为：培养温度35-38℃，培养时机od600值为0.4-1.6，培养基为lb培养基并添加质量分数为1.5%-6%的麦芽糖。
16、优选的，所述重组菌株生产α-乳白蛋白的培养条件为：培养温度37℃，培养时机od600值为0.8，培养基为lb培养基并添加质量分数为3%的麦芽糖。
17、本发明还提供了所述的信号肽或者所述的重组菌株在制备乳制食品或保健品中的应用。
18、本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：
19、（1）本发明成功地将α-乳白蛋白基因 lal ba进行克隆，并经测序鉴定后将其成功构建于穿梭质粒pbe-s中得到重组质粒pbe- lalba。随后将其转化进入枯草芽孢杆菌rik1285得到重组菌株rik1285-pbe- lalba，其能够分泌α-乳白蛋白。
20、（2）本发明将来自枯草芽孢杆菌168基因组的同源信号肽文库连接于 lalba中得到重组质粒文库，并从信号肽文库中筛选出能够帮助α-乳白蛋白进行分泌表达的31种不同的信号肽，其中最佳信号肽yjcn能将α-乳白蛋白的产量最高提升至119.76 μg/ml，得到由yjcn信号肽驱动的菌株rik1285-pbe-yjcn- lalba，且α-乳白蛋白的产量与信号肽的gravy和疏水性呈低正相关性。本发明还筛选了3种启动子（papre、p43、pglv），并证实诱导型启动子pglv能够最大程度上提高α-乳白蛋白的表达量至122.04 μg/ml，组成型启动子p43也能够促进一定程度的蛋白表达。同时，本发明对诱导型启动子的诱导条件进行了优化，菌株rik1285-pbe-pglv-yjcn- lalba在添加麦芽糖质量分数为3％，添加麦芽糖时机od600为0.8时可以达到最佳的表达量。
21、（3）本发明在重组α-乳白蛋白的安全性评价试验中，判定重组α-乳白蛋白没有急性毒理作用。因此，人α-乳白蛋白在枯草芽孢杆菌中的成功表达和分泌且具有食用安全性，为模拟婴儿配方奶粉的母乳和开发生物工程乳奠定了基础，由此本发明提供了一种新生产α-乳白蛋白的枯草芽孢杆菌表达系统，具有大规模生产α-乳白蛋白的潜力，有助于牛奶或其他蛋白质的生物合成，进而开发人造乳制品等产品。