一种鲍HMGR抑制肽及应用的制作方法

本发明涉及鲍hmgr抑制肽，具体涉及一种鲍hmgr抑制肽、制备及应用。

背景技术：

1、近年来高血脂症患病人群越来越趋于年轻化，高血脂症也是心脑血管疾病、糖尿病和多种癌症等慢性疾病的重要危险因素。目前在临床中使用较多的降血脂药物多为他汀类药物，据可靠研究，他汀类药物的使用会有主要两方面的副作用，一个是转氨酶升高，一个是肌肉痛的不良反应风险。因此，加大天然、无毒害降血脂食品的研究力度时非常迫切的。

2、目前人们对鲍鱼的加工利用主要集中在罐头、冷冻、鲜销等，鲍鱼的精深加工利用较低、下脚料浪费严重。现已有的对鲍鱼活性的研究主要集中在性腺、内脏、壳以及鳃等下脚料的抗氧化活性上，鲜有关于降血脂活性的研究。而开发安全、无毒害的天然降血脂产物的需求又比较迫切。因此，本文以真空冷冻干燥的鲍鱼内脏为原料，开发具有降血脂功效的鲍鱼肽，能够对鲍下脚料的高值化加工利用提供新思路，也为开发天然降血脂产品拓展了资源。

3、传统生物hmgr抑制肽的筛选制备方法是先酶解，酶解液经超滤后再进一步纯化制备得到肽，常规方法中纯化步骤耗时耗力，并且花大成本制备得到的肽不一定具有靶向活性。

4、因此，本文以真空冷冻干燥的鲍鱼内脏为原料开发具有降血脂功效的鲍鱼肽，能够对鲍下脚料的高值化加工利用提供新思路，也为开发天然降血脂产品拓展了资源。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种鲍hmgr抑制肽、其筛选制备方法及应用，通过计算机辅助软件辅助筛选出的鲍hmgr抑制肽，具有抑制细胞内总胆固醇与总甘油三酯积累等功效，有助于开发成天然降血脂产品。

2、为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

3、一种鲍hmgr抑制肽，其特征在于，该种鲍hmgr抑制肽来源于内脏、性腺等鲍鱼下脚料；氨基酸序列为：丝氨酸-脯氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-组氨酸，缩写为：spadigfh。

4、进一步地，所述的一种鲍hmgr抑制肽，在制备、辅助降血脂、降胆固醇、抗氧化损伤的产品中的应用。

5、一种鲍hmgr抑制肽的筛选和制备方法：

6、s1：酶解制备<1kda的鲍混合肽：利用碱性蛋白酶酶解鲍鱼内脏，酶解结束灭酶后经平板离心机离心，再使用陶瓷膜粗滤，得到的滤出液经<1kda的膜超滤，最终得到<1kda分子量的混合肽，冷冻干燥成粉末；

7、s2：鉴定鲍混合肽氨基酸序列：取适量<1kda的混合肽经c18除盐柱进行除盐，将样品经由配备在线纳喷离子源的lc-ms/ms分析；获得多种鲍混合肽的序列；

8、s3：虚拟筛选：以蛋白质hmgr的3d结构作为受体，运用对接软件discovery studio2019对hmgr分子加氢、去水，进行能量最小化处理，用单肽分子以discovery studio2019client绘制小分子作为配体，确定hmgr的活性口袋，进行虚拟筛选；

9、s4：hmgr抑制肽固相合成：将虚拟筛选的结果通过grid score得分进行排名，根据排名和相互作用的情况，挑选出与口袋结合相互作用力的较强的单肽进行固相合成，获得所述鲍hmgr抑制肽，经rp-hplc和lc/ms鉴定纯度及分子量。

10、进一步地，s2的具体步骤为：整套系统为串联easy-nanolc 1200的q-exactiveplus质谱仪，共上样1μl样品(分析柱：acclaim pepmap c18，75μm x 25cm)，以60min的梯度分离样品，柱流量控制在300nl/min，柱温为40℃，电喷雾电压2kv，梯度从2％的b相起始，在47分钟以非线性梯度升高到35％，后1分钟内升高到100％，维持12分钟；质谱仪在数据依赖采集模式下运行，自动在ms和ms/ms采集间切换，质谱参数设置如下：

11、(1)ms：扫描范围(m/z)：200-2000；分辨率:70000；agc target：3e6；最大注入时间：50ms；(2)hcd-ms/ms：分辨率：17500；agc target：1e5；最大注入时间：45ms；碰撞能量：28；动态排除时间：30s。

12、进一步地，s3步骤中：所述的蛋白质hmgr的3d结构从rcsb蛋白质数据库下载人3-羟基-3甲基-戊二酸单酰辅酶a还原酶(天然)的晶体结构；所述的hmgr的活性口袋为口袋范围8，盒子边缘4。

13、本发明的有益效果：

14、1、本发明所筛选制备出的鲍hmgr抑制肽spadigfh在体外细胞实验中，不同浓度均抑制了hep-g2细胞中总胆固醇(tc)、总甘油三酯(tg)的积累，且细胞内总胆固醇、总甘油三酯的积累水平随处理浓度的提高而下降，400μm时差异最显著(p<0.01)。说明多种浓度的鲍hmgr抑制肽spadigfh均能够抑制细胞中总胆固醇、总甘油三酯的积累，具有降血脂、降胆固醇的功效，有利于开发天然降血脂产品，或拓展其在制备、辅助降血脂、降胆固醇的产品中的应用。

15、2、本发明所筛选制备出的鲍hmgr抑制肽spadigfh对胆固醇胶束溶解度抑制率随着单肽处理浓度升高而提升，处理浓度为400μm时效果最明显。

16、3、本发明所筛选制备出的鲍hmgr抑制肽spadigfh对多种细胞在高浓度的情况下对细胞活力、细胞生长均无显著性影响，说明鲍hmgr抑制肽spadigfh对细胞无毒性，符合降血脂、降胆固醇、抗氧化损伤产品的安全性，具有制备、辅助降血脂、降胆固醇、抗氧化损伤的产品中的应用的价值和可能性。

17、4.本发明所筛选制备出的鲍hmgr抑制肽spadigfh对氧化损伤的体外细胞也有保护效果，处理浓度在50μm时单肽对l02细胞呈现出显著的氧化损伤保护效果(p＜0.05)，且随着浓度升高效果越明显。具有抗氧化损伤的功效，有利于开发天然抗氧化产品，或拓展其在制备、辅助抗氧化损伤的产品中的应用。

18、5、此外，本发明中所使用的筛选和制备方法相较于传统方法具有花费时间少、所得hmgr抑制肽产物靶向性、功效性好的优势。本方法的思路是对酶解后的混合肽通过s3步骤虚拟筛选，根据计算机软件的评分，选出综合排名较高的肽段，再用体内体外的试验验证肽的活性功能，打破传统一一制备、实验验证的思路。

19、一方面，常规酶解制备肽的方法是先酶解，酶解液经超滤后再进一步纯化制备得到肽，常规方法中纯化步骤耗时耗力，而直接用计算机辅助软件进行虚拟筛选的方案大大减少了得到hmgr抑制肽所需的时间；另一方面，常规酶解制备的hmgr抑制肽大多不具备的靶向性、功能性较弱，本发明中所使用的筛选和制备方法使用计算机辅助软件虚拟筛选，得到的hmgr抑制肽具有显著的靶向活性功能。

20、6、本发明利用鲍鱼内脏等下脚料为原料开发出一种鲍hmgr抑制肽，对鲍下脚料的高值化加工利用提供新思路，也为开发天然降血脂、抗氧化损伤产品拓展了资源。

21、7、本发明首次使用discovery studio等计算机软件筛选技术应用于鲍鱼提取肽的分析，通过大量实验和虚拟比对确定了鲍鱼hmgr抑制肽筛选的活性口袋为口袋范围8和盒子边缘4的筛选范围，列出了高得分的肽段清单。该方法在短时间内排除鲍鱼下脚料中存在的大量靶向不明确、效果不准确的无关肽段，为后续鲍鱼提取物的活性成分研究提供思路和可行范围，有助于缩短研发时间，提供了高效、低成本的研究思路。

22、8、相较于传统的成分混杂的鲍鱼提取物，本发明利用虚拟筛选技术开发出一种鲍hmgr抑制肽，肽序列结构明确，且具有明显靶向性，为以后开发辅助性产品以及在未来活性物质的协同使用方面提供了可能。